Table of Contents

Биореакторные системы стали незаменимыми инструментами в области тканевой инженерии, предлагая исследователям точно контролируемую среду для культивирования сложных опорно-двигательных тканей, таких как сухожилия и связки. В отличие от простой статической культуры, биореакторные системы позволяют применять динамические физические силы, которые необходимы для руководства поведением клеток и созреванием тканей. Среди многих параметров, влияющих на успешное формирование тканей, механический стресс выделяется как критический детерминант. При правильном применении механические стимулы могут направлять дифференцировку стволовых клеток, усиливать осаждение и выравнивание компонентов внеклеточного матрикса (ECM) и в конечном итоге давать трансплантаты с механическими свойствами, которые приближаются к таковым из нативных сухожилий и связок. Эта статья обеспечивает углубленное изучение того, как механический стресс используется в биореакторах для содействия образованию сухожилий и связочных тканей, охватывая основные биологические механизмы, типы стимулов, практические стратегии применения, текущие результаты исследований и будущие проблемы.

Роль механического стресса в развитии тканей

Тендоны и связки являются узкоспециализированными соединительными тканями, которые испытывают постоянную механическую нагрузку во время ежедневного движения. Они передают силы между мышцами и костями или стабилизируют суставы, соответственно. Их родная архитектура характеризуется плотными параллельными коллагеновыми волокнами, преимущественно коллагеном I типа, организованным иерархическим образом, чтобы выдерживать высокие растягивающие нагрузки. Клетки в этих тканях — теноциты в сухожилиях и фибробласты связок — являются механочувствительными: они непрерывно ощущают и реагируют на механические сигналы посредством процесса, известного как механотрансдукция. В организме эта механическая среда динамична, включающая циклические растяжения, сжатие и силы сдвига. Применение аналогичных напряжений in vitro в биореакторах имитирует эти естественные условия, запустив сигнальные пути, которые регулируют пролиферацию клеток, выравнивание и синтез ECM.

Пути механотрансдукции

Механический стресс преобразуется в биохимические сигналы посредством механотрансдукции. Ключевые игроки включают интегралы, фокальные спайки и цитоскелет. Когда клетка растягивается, интеграны связываются с белками ECM и передают силу цитоскелету через фокальные адгезионные комплексы. Это активирует нисходящие сигнальные каскады, такие как путь Rho/ROCK и путь Wnt/β-катенина. Эти пути в конечном итоге влияют на экспрессию генов, связанных с синтезом коллагена, матричными металлопротеиназами (MMP) и теногенной дифференциацией. Например, было показано, что циклический растяжимый штамм повышает регуляции склераксиса (Scx), фактор транскрипции, критически важный для развития сухожилий, а также теномодулин (Tnmd) и экспрессия коллагена I типа. Более глубокое понимание этих путей позволяет исследователям точно настраивать протоколы механической нагрузки для максимизации желаемых клеточных реакций

Источник и механическое кондиционирование

Выбор источника клеток также переплетается с применением механического напряжения. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из костного мозга, жировой ткани или пуповины, обычно используются для инжиниринга сухожилий / связки из-за их многолинейного потенциала. Однако без механических сигналов МЦК могут дифференцироваться в нецелевые линии, такие как кость или хрящ. Применение соответствующего растяжения может направлять МЦК к теногенному или связкогенному фенотипу, характеризующемуся удлиненной морфологией клеток, выравниванием вдоль оси деформации и экспрессией связанных с сухожилиями маркеров. Аналогично, зрелые теноциты или фибробласты связок требуют механической стимуляции для поддержания своего фенотипа и предотвращения дифференциации. Биореакторы, таким образом, служат платформой для доставки этих критических механических входов контролируемым, воспроизводимым образом ]2 .

ECM Ремоделирование и прочность тканей

Помимо передачи сигналов клетки, механическое напряжение напрямую влияет на организацию и ремоделирование ECM. Тендоны и связки получают свою прочность на растяжение из иерархического расположения коллагеновых фибрилл. В статической культуре коллагеновые волокна имеют тенденцию быть случайным образом ориентированными, что приводит к плохим механическим свойствам. Циклическое растяжение выравнивает вновь синтезированные коллагеновые волокна параллельно направлению деформации, имитируя анизотропию нативной ткани. Кроме того, механическая нагрузка может усиливать лизиловококсидазу (LOX), фермент, который сшивает коллагеновые волокна, дополнительно повышая прочность на растяжение. Слишком малое напряжение приводит к недостаточной стимуляции; слишком много может вызвать повреждение клеток или разрыв ткани. 3 .

Виды механических стимулов

Биореактор может применять несколько различных типов механического напряжения, каждый с уникальным воздействием на сухожилия и клетки связок. Три основных стимула - растягивающее напряжение, сжатие и напряжение сдвига. Часто комбинация этих сил более точно имитирует среду in vivo , что приводит к превосходному созреванию ткани.

Растяжение

Растяжение, или растяжение, является наиболее релевантным механическим стимулом для сухожилий и связок, основная функция которых заключается в сопротивлении напряжению. В биореакторах растяжение обычно применяется циклически — неоднократно удлиняя и расслабляя конструкцию ткани. Параметры включают амплитуду (процент удлинения, например, 4-10% от первоначальной длины), частоту (например, 0,1-1 Гц), рабочий цикл (процент времени под напряжением) и общую продолжительность культуры. Исследования показали, что умеренное циклическое растяжение (5-8% удлинение при 0,5-1 Гц) усиливает экспрессию теногенных генов, выработку коллагена и выравнивание в MSC-семенах. Более высокие амплитуды или статическое растяжение могут быть вредными, вызывая апоптоз клеток или образование рубцовой ткани. Расширенные биореакторы позволяют программируемые режимы нагрузки, которые могут быть скорректированы с течением времени (например, протоколы наращивания для постепенного увеличения напряжения) для имитации этапов заживления или развития.

Сжатие

Сжимающие силы менее доминируют в физиологии сухожилий и связок, но все же встречаются, особенно там, где сухожилия обернуты вокруг костных шкивов (например, надспинатусное сухожилие) или во время сжатия суставов. В биореакторах сжатие может применяться через пластины или пневматические приводы. Было показано, что комбинированное сжатие и напряжение (например, в модели сгибательного сухожилия шкива) производят более сложную ECM с областями фиброкартиля, похожими на нативные переходные зоны. Однако для большинства приложений сжатия сухожилий и связок сжатие используется в качестве дополнения к напряжению, а не в качестве основного стимула.

Стресс стрижка

Стресс сдвига возникает из потока жидкости по поверхности клеток или тканевых конструкций. В биореакторах это достигается путем перфузии — накачки культуральной среды через пористые каркасы или вокруг конструкций. Стресс сдвига не только доставляет питательные вещества и удаляет отходы, но и механически стимулирует клетки. Для сухожилий и связок стресс сдвига может имитировать силы трения, испытываемые во время совместного движения или интерстициального потока жидкости, который происходит во время загрузки. Исследования показывают, что низкие уровни напряжения сдвига (0,1-1 дюн / см2) могут повысить синтез ECM и выравнивание клеток, в то время как высокий сдвига может вызвать отслоение клеток. Комбинирование сдвига с растягивающим напряжением в одном биореакторе (например, в вращающемся стеночном сосуде или в проточной камере) может производить ткани с превосходными механическими свойствами по сравнению с любым стимулом в одиночку.

Стратегии применения механического стресса в биореакторах

Успешная интеграция механического напряжения в систему биореакторов требует тщательного рассмотрения механической конструкции, системы управления и архитектуры каркаса. Ниже приведены несколько общих стратегий, а также ключевые инженерные параметры, определяющие эффективность.

Динамические системы загрузки

Динамические системы нагрузки представляют собой рабочую лошадку сухожилий/связочных биореакторов. Они обычно состоят из механического привода (например, линейного двигателя, пневматического цилиндра или шагового двигателя), прикрепленного к одному концу каркаса или конструкции ткани, в то время как другой конец фиксируется. Привод применяет циклическое смещение (штамм) или силу (нагрузка). Управление замкнутым контуром с нагрузочной ячейкой обеспечивает точную регуляцию величины напряжения. Многие коммерческие и специально построенные системы могут применять несколько каналов одновременно, позволяя проводить эксперименты с высокой пропускной способностью. Могут быть запрограммированы такие параметры, как форма волны (син, треугольный, квадратный), частота и периоды отдыха. Например, протокол рампы-и-холдинга, который постепенно увеличивает напряжение в течение недель, может производить более прочную ткань, чем постоянная синусоидальная нагрузка.

Растяжка устройств и мембранных биореакторов

Для клеточных мембран или тонких конструкций используются растягивающие устройства, которые удлиняют гибкую мембрану. Клетки культивируют на эластичной подложке (например, силиконе или полиуретане), равномерно растянутой. Для изучения клеточной механобиологии широко используется этот подход. Для тканевой инженерии применяются аналогичные принципы: каркас крепится к подвижным зажимам и циклически растягивается. Некоторые устройства включают в себя множественные оси растяжения (биаксиальные или многоосные) для имитации сложной деформации сухожилий, когда они деформируются вокруг суставов. Однако одноосный штамм остается наиболее распространенным, поскольку он непосредственно выравнивается с нативным направлением коллагенового волокна.

Жидкие системы и перфузионные биореакторы

Перфузионные биореакторы не только усиливают транспортировку массы, но и обеспечивают сдвиговое напряжение. В этих системах культуральная среда непрерывно прокачивается через пористый каркас или вокруг конструкции. Скорость потока, геометрия канала и пористость каркаса определяют величину напряжения сдвига. Для сухожилий и связок одна только перфузия может улучшить жизнеспособность клеток и осаждение матрицы по сравнению со статической культурой. При сочетании с механическим растяжением (как в биореакторе перфузионного растяжения) сообщалось о синергетическом воздействии на выравнивание коллагена и механические свойства. Некоторые передовые системы также включают датчики оксигенации и контроль pH для поддержания оптимальных условий во время долгосрочной культуры.

Многоосевые и сложные системы погрузки

Нативные сухожилия и связки испытывают не только простое напряжение, но и торсионное, изгибающее и сдвигающее. Для лучшего воспроизведения этой сложности были разработаны многоосевые биореакторы. Например, система, которая одновременно применяет осевое напряжение и торсионное вращение, может производить спирально расположенные коллагеновые волокна, подобные тем, которые находятся в ахилловом сухожилии. Другой подход использует гибкую нагрузочную раму, которая может независимо контролировать напряжение и сжатие. Хотя эти системы более сложны для проектирования и проверки, они обещают для инженерных анатомически реалистичных трансплантатов. Будущие разработки могут включать визуализацию в реальном времени и обратную связь для адаптации моделей нагрузки на основе созревания тканей.

Оптимизация механических параметров

Независимо от конкретной конструкции биореактора, оптимизация параметров механической нагрузки имеет решающее значение. Следующие рекомендации основаны на опубликованных исследованиях:

  • Степень напряжения: 4-10% циклический растяжимый штамм является широко полезным; более низкие штаммы (<2%) may not elicit a response, while higher (>]12%) могут вызвать гибель клеток.
  • Частота: 0,5-1 Гц (частота походки человека) обычно используется; более медленные частоты могут уменьшить эффект.
  • Продолжительность и отдых: Прерывистая нагрузка (например, 1 час на, 1 час на выходе, или 8% напряжённость в течение 8 часов с последующим 16 часами отдыха) часто дает лучшие результаты, чем непрерывная нагрузка из-за клеточной адаптации.
  • Направление: Одноосный штамм вдоль длинной оси каркаса способствует выровнению коллагена; биаксиальный штамм может использоваться для более сложных геометрий.
  • Предварительное кондиционирование: Постепенное увеличение деформации с течением времени (например, от 2% до 8% в течение 2–3 недель) имитирует развитие in vivo и предотвращает повреждение тканей.

Эти параметры должны быть адаптированы к конкретному типу ячейки, материалу каркаса и стадии созревания.Мониторинг жесткости конструкции в режиме реального времени (через обратную связь с силой) может направлять адаптивные протоколы загрузки 4 .

Влияние на регенерацию тендонов и связок

Многочисленные исследования показали, что применение механического стресса в биореакторах значительно улучшает качество сконструированных тканей сухожилий и связок. Преимущества охватывают свойства от клеточного до тканевого уровня.

Улучшенная организация и состав коллагена

Одним из наиболее последовательных выводов является то, что циклический растяжной штамм способствует плотным, выровненным коллагеновым волокнам. Например, исследования с использованием каркасов MSC-семена коллагена-GAG показали, что после двух недель динамической нагрузки коллагеновые волокна были сильно выровнены по оси штамма, с 2-3-кратным увеличением общего содержания коллагена по сравнению со статическими элементами управления. Соотношение коллагена типа I к типу III также сместилось в сторону более сухожилия-подобного профиля. Эта улучшенная организация напрямую приводит к более высокой прочности на растяжение и модуля.

Улучшенные механические свойства

Кондиционированные биореактором конструкции часто демонстрируют механические свойства, которые приближаются к более низкому диапазону нативных сухожилий. В знаковом исследовании, сконструированные в биореакторе натяжения-перфузии, достигшие прочности на растяжение 30-40% нативного сухожилия после 12 недель культивирования. Другие группы сообщили о предельной прочности на растяжение 5-15 МПа для инженерных каркасов по сравнению с 1-2 МПа для статических элементов управления. Хотя эти результаты все еще уступают нативной ткани (60-100 МПа), эти результаты представляют собой важный шаг вперед. Ожидается, что дальнейшая оптимизация протоколов загрузки и материалов каркасов закроет этот разрыв.

Поддержание клеточного фенотипа

Механическая нагрузка также помогает поддерживать дифференцированный фенотип клеток. Теноциты, культивируемые в статических условиях, постепенно теряют свою удлиненную морфологию и экспрессируют более низкие уровни теногенных маркеров. Напротив, клетки, подвергшиеся циклическому деформации, сохраняют свой фенотип и остаются метаболически активными в течение длительных периодов. Для МСК наличие механического стресса может подавлять нежелательную остеогенную или хондрогенную дифференцировку, направляя их к теногенной линии. Это критически важно для развития трансплантатов, которые будут интегрироваться и функционировать после имплантации.

В Vivo интеграция и производительность

При имплантации в модели животных механически обусловленные инженерные сухожилия и связки демонстрируют превосходную интеграцию с тканью хозяина. Они демонстрируют лучшее образование неотендона, снижение воспаления и улучшенную несущую способность. Например, прививка механического аллотрансплантата ахиллова сухожилия в модели крысы привела к функциональному восстановлению через 6 месяцев, с гистологическими доказательствами инфильтрации клеток хозяина и ремоделирования коллагена. Статические конструкции, напротив, часто механически не работают или становятся рубцовыми. В то время как долгосрочные данные человека ограничены, предварительные клинические испытания с использованием биореакторно-расширенных клеточных листов или ЭХМ каркасов показали перспективу для лечения разрывов сухожилий и разрывов связок 5 .

Будущие направления и вызовы

Несмотря на прогресс, остаются несколько основных препятствий, прежде чем биореакторные сухожилия и связки станут обычными клиническими вариантами.

Подражание естественной механической среде

Современные биореакторы обычно применяют простую циклическую нагрузку, тогда как нативные ткани испытывают сложные, изменяющиеся во времени стрессовые паттерны, которые включают периоды отдыха, всплески высокой интенсивности и многоосные силы.Разработка систем, которые могут воспроизводить эти паттерны, например, с помощью программируемых профилей загрузки или путем включения датчиков in situ, остается активной областью исследований.

Контроль в реальном времени и контроль обратной связи

Для оптимизации роста тканей необходимо со временем контролировать такие параметры, как жизнеспособность клеток, осаждение ECM и механическая жесткость. Интеграция неинвазивных датчиков (например, ультразвуковой, оптической когерентной томографии) или электрического импеданса в биореакторах позволила бы исследователям регулировать нагрузку в режиме реального времени. Разрабатываются системы управления замкнутым контуром, которые модулируют штамм на основе жесткости тканей, но они пока не широко используются.

Масштабирование и клинический перевод

Большинство исследований биореакторов проводятся на небольших лабораторных конструкциях (например, 1-2 см в длину). Клинически релевантные трансплантаты (например, пателлярное сухожилие человека составляет около 10 см в длину) требуют биореакторов, которые могут вмещать большие размеры при сохранении равномерного механического напряжения и доставки питательных веществ. Масштабирование является сложной задачей из-за ограничений массового транспорта и трудности применения однородного штамма на большой конструкции. Достижения в конструкции каркаса (например, перфузионные каналы) и приводные массивы могут помочь.

Пациент-специфическая кастомизация

Отдельные пациенты имеют различные анатомические особенности, модели травм и способности к заживлению. Будущие системы биореакторов могут включать клетки, полученные от пациента (например, аутологичные МСК), и использовать медицинскую визуализацию (МРТ или КТ) для разработки пользовательских каркасов и протоколов загрузки. Этот персонализированный подход может максимизировать интеграцию трансплантата и функциональное восстановление.

Стандартизация и одобрение регулирующих органов

Системы биореакторов широко варьируются между исследовательскими группами, что затрудняет сравнение результатов или установление наилучшей практики. Для ускорения одобрения регулирующих органов для клинического использования необходимы отраслевые стандарты для производительности биореактора, материалы каркаса и контроль качества. Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) выпустило проект руководства по тканевой инженерии медицинских продуктов, но конкретные требования к трансплантатам, генерируемым биореакторами, остаются ограниченными.

Заключение

Механический стресс является краеугольным камнем функциональной сухожилия и связочной ткани инженерии. Тщательно контролируя тип, величину, частоту и продолжительность механических стимулов, биореакторы могут направлять клетки для создания организованных, сильных и имплантируемых тканевых конструкций. Способность воспроизводить нативную механическую среду - пока еще работа в процессе - уже дала трансплантаты, которые превосходят статические культуры в каждой метрике от выравнивания коллагена до интеграции in vivo. По мере развития технологии биореактора для включения многоосной нагрузки, мониторинга в реальном времени и персонализированной настройки, мечта о готовом или специфичном для пациента сухожилии и замене связок становится все более достижимой. Продолжение сотрудничества между инженерами, биологами и клиницистами будет иметь важное значение для преодоления оставшихся проблем и перевода этих перспективных технологий из лаборатории в операционную.