Вторжение соленой воды и засоление почвы представляют собой растущие угрозы для глобального производства риса, особенно в дельта-регионах, таких как дельта Меконга во Вьетнаме, дельта Ганга-Брахмапутры в Бангладеш и прибрежных районах Китая и Индии. Повышение уровня моря, чрезмерная добыча подземных вод и плохая практика орошения усугубляют проблему, делая миллионы гектаров некогда продуктивных рисовых полей маргинальными или полностью бесплодными. Обычная селекция достигла постепенного роста толерантности к соли, но темпы этого роста слишком медленные, чтобы идти в ногу со скоростью засоления. Генная инженерия предлагает прямой, точный и потенциально более быстрый путь для разработки сортов риса, которые могут поддерживать стабильность урожайности при соленом стрессе. В этой статье исследуются биологические основы солевого стресса, применяемые генетические инструменты, ключевые гены и пути, которые исследуются, недавние успехи на местах и социально-технические проблемы, которые остаются до того, как эти инновации могут достичь фермерских полей.

Биология солевого стресса в рисе

Сольное напряжение в рисе — это прежде всего двухфазное явление. Первая фаза, осмотическое напряжение, возникает в течение минут — часов после воздействия высоких концентраций соли. Высокая ионная прочность почвенного раствора снижает градиент водного потенциала, затрудняет увлажнение листьев, закрытие стомата и уменьшение расширения клеток. Вторая фаза, ионная токсичность, развивается в течение дней — недель по мере накопления в стримых тканях ионов натрия (Na+). В отличие от многих гликофитов, рис особенно чувствителен к накоплению Na+. Натрий вытесняет калий (K+) в критических местах связывания в ферментах и нарушает синтез белка, транспорт электронов фотосинтеза и целостность мембраны также может накапливаться до токсических уровней, хотя рис относительно более терпим к хлориду, чем к натрию.

Дополнительные вторичные напряжения включают окислительное повреждение от активных форм кислорода (ROS), произведенных под напряжением соли, дисбаланс питания (например, снижение поглощения кальция и магния) и гормональную дисрегуляцию, особенно абсциссовой кислоты и этилена. Общий результат - серьезное сокращение количества паник, длины паники, фертильности шипоклет и наполнения зерна. Потери урожайности могут превышать 50% в умеренно соленых почвах (электрическая проводимость 6-8 дС / м) и являются полными в высокосоленых почвах (выше 10 дС / м). Понимание этих механизмов имеет важное значение для выбора соответствующих генетических мишеней для инженерии.

Ограничения традиционного разведения

Обычная селекция для толерантности к соли в рисе проводилась в течение десятилетий, с умеренным успехом. Сальтол , первоначально идентифицированный в Landrace Pokkali, был введен в популярные сорта, такие как IR64 и BR11, с использованием обратного скрещивания с помощью маркеров. Однако Сальтол в первую очередь обеспечивает толерантность на стадии саженца; он предлагает ограниченную защиту на репродуктивных стадиях. Кроме того, толерантность к соли представляет собой полигенную, сложную черту, включающую десятки генов. Традиционная рекомбинация перетасовывает большие хромосомные блоки и может привести к связанным вредным аллелям. Время генерации длинное (2-3 года за цикл для инбредных линий) и скрининг фенотипа в контролируемых солевых условиях является дорогостоящим. Селекционный отбор с помощью маркера ускорил процесс, но все еще не может получить доступ к генам за пределами доступного пула зародышевой

Генная инженерия подходы

Трансгенная сверхэкспрессия

Самая ранняя и все еще наиболее распространенная стратегия генной инженерии включает в себя вставку одного или нескольких трансгенов под сильный конститутивный или индуцируемый стрессом промотор. Переэкспрессия ионных транспортеров, таких как OsNHX1 (вакуолярный Na+/H+ антипортер), увеличивает секвестрацию Na+ в вакуоли, тем самым снижая цитосолевая токсичность. В тепличных испытаниях трансгенный рис сверхэкспрессирующий OsNHX1 показал до 30% более высокий урожай зерна под напряжением соли по сравнению с контрольными органами дикого типа. Аналогично, сверхэкспрессия OsHKT1;5, транспортер выращивания натрия, уменьшает накопление Na+ в листовых лезвиях, выгружая его из транспирационного потока обратно в корни. Эти модификации одного гена были

Трансгенные подходы также включают введение генов, кодирующих совместимые растворители (например, трегалозу, глицин бетаин, пролин), которые помогают поддерживать осмотический баланс и защищать макромолекул. Например, слияние генов TPSP из дрожжей, когда экспрессируется в рисе, повышает уровень трегалозы и улучшает переносимость соли. Другим хорошо изученным геном является LEA (поздний обильный эмбриогенез) гены белка, которые стабилизируют клеточные структуры во время стресса обезвоживания. Укладка нескольких трансгенов в одной линии — так называемая «генная пирамида» — изучается для решения множественности реакций солевого стресса.

CRISPR-Cas геномный редактирование

Технология CRISPR-Cas предлагает более точную альтернативу трансгенезу. Вместо того, чтобы вставлять чужеродную ДНК, CRISPR-Cas9 или базовые редакторы могут модифицировать существующие гены риса для улучшения их функции или изменения регуляторных последовательностей. Например, исследователи использовали CRISPR для нарушения OsRR22, отрицательного регулятора толерантности к соли, что приводит к повышению толерантности к соли в редактировании. Другой целью является OsDST (перенос засухи и соли), ген, чей нокаут приводит к снижению плотности стомата и повышению эффективности использования воды при засолении. Поскольку многие страны (включая Соединенные Штаты и Японию) дерегулировали определенные культуры, отредактированные CRISPR, которые не содержат чужеродной ДНК, этот подход может столкнуться с меньшими регуляторными препятствиями, чем трансгенные сорта.

Редактирование базы — более новый вариант CRISPR — позволяет заменять одиночные нуклеотиды без создания двухцепочечных разрывов. Этот метод может быть использован для воссоздания полезных аллелей, обнаруженных у диких родственников или ландрейсов непосредственно в элитных сортах. Например, точечная мутация в промоторе OsHKT1;5, которая увеличивает его экспрессию в побеге, может быть введена посредством редактирования базы, обеспечивая безтрансгенный путь к повышенной толерантности к соли.

Ключевые гены и пути, находящиеся под следствием

Помимо вышеупомянутых переносчиков, несколько других генных семейств активно разрабатываются для устойчивости к соли в рисе:

  • SOS путь : Соль чрезмерно чувствительный (SOS) путь, включающий SOS1 (плазма мембраны Na+/H+ антипортер), SOS2 (белковая киназа) и SOS3 (кальциевый датчик) — имеет решающее значение для Na+ исключение из корня. Было показано, что сверхэкспрессия OsSOS1 снижает накопление Na+ и улучшает рост при солевом стрессе.
  • Семейство OsHAK: Члены семейства HAK/KUP/KT, в частности OsHAK5 и OsHAK21, являются транспортерами с высокой аффинностью K+, которые помогают поддерживать гомеостаз K+/Na+. Переэкспрессия OsHAK5 улучшает поглощение K+ при солевом стрессе.
  • Вакуолярная H+-PPase: Ген AVP1 (от Arabidopsis) кодирует вакуумный протонный насос, который генерирует протонную движущую силу, необходимую для секвестрации Na+ через NHX-обменники. Трансгенный рис, экспрессирующий AVP1, показал повышенное накопление вакуолярного Na+ и большую переносимость соли.
  • Факторы транскрипции: Несколько факторов транскрипции регулируют нижележащие гены, реагирующие на соль. OsbZIP72, OsNAC5, OsWRKY45 и OsMYB91 — все они чрезмерно экспрессируются в рисе с положительным влиянием на переносимость соли. Эти регуляторные гены часто приносят плейотропные преимущества, включая улучшенную переносимость засухи и холода.
  • miRNAs: МикроРНК, такие как miR156, miR393 и miR396, модулируют реакции солевого стресса, нацеливаясь на факторы транскрипции, связанные со стрессом. Манипулирование экспрессией miRNA с использованием искусственных конструкций miRNA является новой стратегией.

Интегративный подход — объединение геномики, транскриптомики и метаболомики — в настоящее время используется для выявления наиболее перспективных комбинаций мультигенов. Например, недавнее исследование совместно экспрессировало OsNHX1 с OsBADH1 (который синтезирует глицин бетаин) и обнаружило синергетические улучшения как в секвестрации Na+, так и в осмотической адаптации.

Последние прорывы и результаты полевых испытаний

Несколько линий генно-инженерного солеустойчивого риса продвинулись от теплицы к полевым испытаниям за последние пять лет. В Китае трансгенная линия, сверхэкспрессирующая OsHKT1;5 под корнеспецифическим промотором, поддерживала 80% выход по сравнению с обычными средствами контроля при обработке 60 мМ ирригационной воды NaCl. В Бангладеш исследователи Международного института исследований риса (IRRI) и партнерских учреждений разработали линию BRRI dhan28 с нарушенным OsRR22 геном; предварительные полевые испытания в прибрежных районах показали преимущество в 25% выходе над родительским сортом при умеренной солености. В Индии трансгенный рис, содержащий ген SacB от Bacillus subtilis (который кодирует фермент левансукраза, ответственный за синтез ос

Возможно, наиболее амбициозным проектом является проект C4 Rice, поддерживаемый Фондом Билла и Мелинды Гейтс, который направлен на установку более эффективного фотосинтетического пути C4 в рис. В то время как основная цель - более высокий потенциал урожайности, рис C4 также демонстрирует улучшенную эффективность использования воды, что косвенно придает лучшую толерантность к осмотическому стрессу, вызванному соленостью. Хотя проект все еще находится в разработке, он уже генерировал трансформаторы со значительными анатомическими изменениями в клетках листовой оболочки.

Эти результаты обнадеживают, но важно отметить, что большинство полевых испытаний проводятся на относительно небольших участках в управляемых солевых условиях, а не в высокоразнородных динамических градиентах солености, обнаруженных в реальных сельскохозяйственных средах. Масштабирование и проверка в различных агроэкологических зонах остается критическим следующим шагом.

Проблемы с усыновлением

Регуляторные и биобезопасные проблемы

Генетически модифицированные культуры сталкиваются со строгими нормативными обзорами во многих странах. Трансгенный солеустойчивый рис, поскольку он содержит ДНК из-за пределов вида, должен пройти обширные оценки продовольственной и экологической безопасности в соответствии с Картахенский протокол по биобезопасности. В Европейском союзе одобрение особенно медленное и политически спорное. Даже в таких странах, как Бангладеш и Филиппины, где были одобрены трансгенные баклажаны Bt и золотой рис, процесс занял более десяти лет. Отредактированные CRISPR линии, которые не содержат трансгенов, могут претендовать на более простые регуляторные пути в Соединенных Штатах, Канаде и Японии, но в ЕС (после решения суда 2018 года) они регулируются как генетически модифицированные организмы (ГМО). Эта непоследовательность создает неопределенность для заводчиков и семенных компаний.

Общественное и потребительское принятие

Скептицизм потребителей по поводу ГМО остается высоким во многих странах, потребляющих рис. В Китае и Индии анти-ГМО-активизм успешно заблокировал коммерческий выпуск нескольких инженерных культур, несмотря на научное одобрение. Недостатки информации о «Франкенфуде» и страх перед корпоративным контролем над поставками продовольствия глубоко укоренились. Несмотря на то, что устойчивый к соли рис не предполагает введения производства пестицидов или толерантности к гербицидам (наиболее спорные черты), стигма, связанная с генной инженерией, может препятствовать принятию. Прозрачная маркировка, программы совместного разведения, в которых участвуют фермеры, и коммуникационные кампании, подчеркивающие ощутимые преимущества, такие как продолжение выращивания риса в районах, затронутых солью, необходимы для укрепления доверия.

Экологические и агрономические соображения

Потенциальные экологические риски включают в себя поток генов от инженерного риса к диким родственникам (например, Oryza rufipogon в Азии). Гены толерантности к соли могут давать селективное преимущество диким видам, потенциально изменяя динамику экосистем. Однако рис преимущественно самоопыляется, и скорость потока генов, как правило, низкая (менее 1% на поколение в типичных полевых условиях). Сосуществование с не-ГМ рисом можно управлять через расстояния изоляции, пограничные ряды и временное разделение. Другая проблема заключается в долгосрочной стабильности инженерного признака: в некоторых линиях наблюдается заглушение трансгена из-за эпигенетических модификаций или совместного подавления. Укладка нескольких независимых трансгенных кассет может снизить риск заглушения, но увеличивает сложность размножения.

Экономические вопросы и вопросы справедливости

Большинство сортов ГМ-риса, устойчивых к соли, разрабатываются учреждениями государственного сектора (например, ИРРИ, национальные системы сельскохозяйственных исследований), а не многонациональными корпорациями. Это преимущество с точки зрения доступности, поскольку эти сорта обычно предназначены для мелких фермеров в развивающихся странах без высоких затрат на семена. Тем не менее, стоимость разработки трансгенного сорта, включая соблюдение нормативных требований и выбор мероприятий, может превышать 10 миллионов долларов. Обеспечение того, чтобы права интеллектуальной собственности и условия лицензирования не ограничивали доступ к бедным фермерам, имеет решающее значение. Биологические платформы с открытым исходным кодом и стратегии патентного пула изучаются для сокращения затрат и поощрения широкого распространения.

Будущие направления

Многослойное редактирование генома

Достижения в технологии CRISPR теперь позволяют одновременно редактировать несколько генов в одном событии трансформации. Например, используя мультиплексную систему CRISPR-Cas9, исследователи могут нацеливаться на несколько отрицательных регуляторов толерантности к соли (например, OsRR22, OsDST, OsSAPK) одновременно, потенциально создавая синергетический эффект. Такой подход может ускорить развитие линий с толерантностью на протяжении всего жизненного цикла растения.

Аллеле Майнинг и синтетическая биология

Дикие виды риса, такие как Oryza coarctata (процветает в соленых прибрежных водах Южной Азии), содержат аллели, которые обеспечивают экстремальную переносимость соли, не встречающуюся в культивируемом рисе. Достижения в области секвенирования с длинным чтением и сборки генома выявили гены-кандидаты от этих диких родственников. Методы синтетической биологии, включая синтез генов, направленную эволюцию и оптимизированный промоторный дизайн, могут затем использоваться для реконструкции этих аллелей в контексте, оптимизированном для риса. Например, транспортер KUP/HAK/KT транспортер из O. coarctata был синтезирован и тестируется в рисовых трансформаторах.

Устойчивость к солености с помощью микробиомной инженерии

Новый дополнительный подход заключается в разработке корневого микробиома для повышения толерантности к соли. Многие галофитные растения полагаются на симбиотические бактерии, которые производят фитогормоны, разлагают предшественники этилена или увеличивают доступность питательных веществ. Хотя это не прямая генетическая модификация рисового растения, прививка семян с солеустойчивыми штаммами Azospirillum или Pseudomonas показала улучшение урожайности на 15-30% в солевых условиях в полевых испытаниях. Комбинирование микробных инокулянтов с генетически улучшенными сортами риса может предложить надежное, уложенное решение.

Интеграция с высокоточным сельским хозяйством и поддержка принятия решений

Даже самый солеустойчивый сорт не может хорошо работать, если уровень засоленности почвы превышает его физиологический потолок. Мониторинг электропроводности почвы в режиме реального времени с использованием датчиков IoT в сочетании с инструментами поддержки принятия решений, которые рекомендуют оптимальное время посадки, режимы орошения и графики выщелачивания, максимизируют преимущества ГМ-разновидностей. Использование мультиспектральной визуализации на основе дронов также может обнаружить ранние признаки солевого стресса, что позволяет фермерам применять целенаправленные вмешательства.

Заключение

Генная инженерия не является серебряной пулей, но она является мощным компонентом более широкой стратегии, чтобы сделать производство риса устойчивым к растущей угрозе засоления почвы. От трансгенной переэкспрессии ионных транспортеров и осмотических протекторов до точного редактирования генома отрицательных регуляторов, набор инструментов значительно расширился за последние два десятилетия. Результаты полевых испытаний, хотя и предварительные, многообещающие: урожайность при умеренной солености может поддерживаться на уровне 70-80% от нестрессовых уровней по сравнению с 40-50% для обычных сортов. Однако для реализации полного потенциала ГМ-солеустойчивого риса требует преодоления нормативной фрагментации, укрепления общественного доверия, управления экологическими рисками и обеспечения того, чтобы технология достигла мелких фермеров, которые нуждаются в ней больше всего. Необходимы постоянные инвестиции в исследования в государственном секторе, зародышевая плазма открытого доступа и фермерские системы семян. При тщательном управлении, инженерный солеустойчивый рис может помочь обеспечить средства к существованию миллионов фермерских семей и внести вклад в глобальную продовольственную безопасность в эпоху изменения климата.

Для дальнейшего чтения см. всесторонние обзоры по теме: Толерантность к соли в рисе: механизмы и генетическое улучшение (Ежегодный обзор биологии растений), CRISPR-Cas9-опосредованное редактирование генома в рисе для стрессоустойчивости (Frontiers in Plant Science)] и IRI прогресс в солеустойчивом рисе . Кроме того, обзор нормативных рамок предоставляется ISAAA Pocket Guide on Genetically Modified Rice .