Table of Contents

Введение: императив созревания сердечной ткани

Сердечно-сосудистые заболевания остаются ведущей причиной смерти во всем мире, что вызывает острую потребность в эффективных методах лечения, которые могут восстановить или заменить поврежденную сердечную мышцу. Регенеративная медицина, особенно сердечная тканевая инженерия, предлагает многообещающий путь вперед, но ее успех зависит от способности производить зрелую, функциональную сердечную ткань в лаборатории. Незрелые кардиомиоциты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток или полученные из неонатальных источников, не могут воспроизвести сократительную прочность, электрофизиологическую стабильность и метаболический профиль взрослых сердечных клеток. Этот разрыв между моделями in vitro и родной тканью побудил исследователей изучить мощную роль механических и электрических сигналов в руководстве созреванием сердца.

Во время естественного развития сердца растущий орган подвергается динамическому взаимодействию физических сил и электрических сигналов, которые коллективно организуют выравнивание клеток, сборку саркомера и формирование синхронизированной электрической сети. Понимание этих сигналов - это не просто академическое занятие; оно обеспечивает план для разработки более эффективных систем культуры и биоматериалов. Путем репликации этих сигналов окружающей среды в лаборатории ученые могут подтолкнуть кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток, ближе к фенотипу взрослого человека, улучшая их полезность для скрининга лекарств, моделирования заболеваний и трансплантации.

Механические сигналы в сердечном созревании

Механические сигналы охватывают физические силы и напряжения, которые сердечные клетки испытывают во время развития и на протяжении всей жизни. Сердце является динамическим насосом, подверженным ритмическому растяжению от наполнения, сдвигающему стрессу от кровотока и сжимающим силам от сокращения. Эти стимулы не являются пассивными побочными продуктами сердечной функции; они активно инструктируют поведение клеток посредством процесса, называемого механотрансдукцией.

Виды механических стимулов

  • Циклическое растяжение — Циклическое расширение и расслабление стенки желудочка во время каждого сердцебиения.В матке сердце начинает биться до того, как камеры полностью сформированы, подвергая растяжению ранние кардиомиоциты, что способствует выравниванию миофибрилла и гипертрофии.
  • Стресс сдвига — сила трения, оказываемая кровотоком на эндотелиальные клетки, выстилающие камеры сердца и сосуды.В то время как стресс сдвига в первую очередь влияет на эндотелиальные клетки, полученная сигнализация паракрина влияет на сердечную мышцу.
  • Подложка жесткости — Механическая жесткость внеклеточного матрикса (ЭКМ). Здоровый взрослый миокард имеет жесткость примерно 10-15 кПа; культуральные субстраты, имитирующие этот эластичный модуль, значительно улучшают созревание кардиомиоцитов по сравнению со стандартным пластиком для культивирования тканей.
  • Биофизическая ограниченность — топографические и геометрические сигналы от ECM, которые определяют форму клеток, выравнивание и ядерную деформацию, влияя на экспрессию генов.

Пути механотрансдукции

Кардиомиоциты ощущают механические силы через сеть интегринов, кадгеринов и ионных каналов, активированных растяжением. Интегрины соединяют ECM с внутриклеточным цитоскелетом, передающим силу ядру через линкер комплекса нуклеоскелета и цитоскелета (LINC). Это физическое соединение изменяет конформацию хроматина и транскрипцию генов. Ключевые нисходящие пути включают в себя совместно-активатор белка (YAP)/транскрипционного со-активатора с сигнальной осью PDZ-связывающего мотива (TAZ), который реагирует на жесткость матрицы и растяжение для регулирования пролиферации против дифференциации. Фокальная адгезионная киназа (FAK) и Rho-GTPases также играют критически важную роль в ремоделировании актинового цитоскелета во время растяжения.

В Vitro применение механических компонентов

Инженерные сердечные ткани получают большую пользу от контролируемой механической нагрузки. Биореакторы, которые применяют циклический одноосный или двуосный растяжение к клеточным семенным каркасам, как было показано, усиливают организацию саркомеров, увеличивают экспрессию зрелых сократительных белков, таких как миозиновая тяжелая цепь (MYH7), и улучшают генерацию сократительной силы. Например, Hirt et al. продемонстрировали, что циклический растяжение, применяемое к сконструированной сердечной ткани (EHT), создает повышенную силу подергивания на 40% по сравнению со статическими элементами управления. Аналогичным образом, растяжение сердечных пластырей перед имплантацией запускает их для лучшей интеграции с тканью хозяина. Недавние исследования также подчеркивают роль механического предварительного кондиционирования в выравнивании коллагеновой матрицы, что, в свою очередь, улучшает электрическую проводимость по всей ткани.

Ключевое открытие: Исследование 2020 года в Биоматериалы показало, что применение 10% циклического штамма при 1 Гц в течение семи дней к индуцированным плюрипотентным стволовым клеткам человека (iPSC)-производные кардиомиоциты увеличили процент клеток с морфологией в форме стержня с 15% до 58%, наряду с заметным увеличением скорости проводимости.

Электрические струи в сердечном созревании

Электрическая сигнализация имеет основополагающее значение для работы сердца. Синоатриальный узел генерирует потенциалы спонтанного действия, которые распространяются через предсердия и желудочки, вызывая скоординированные сокращения. В процессе развития электрическая активность возникает рано и активно формирует созревание сердца. In vitro применение внешнего электрического шага стало стандартным методом улучшения функциональных свойств культивируемых сердечных тканей.

Как электрическая стимуляция влияет на зрелость

Электрическая последовательность обеспечивает контролируемые деполяризующие импульсы, которые вызывают синхронное сокращение кардиомиоцитов. Эта стимуляция повторяет естественную электрическую среду и вызывает несколько событий созревания:

  • Развитие ионных каналов — Кардиомиоциты переходят от эмбриона к профилю экспрессии ионных каналов у взрослых.Ключевые изменения включают в себя повышение регуляции калиевого канала выпрямителя внутрь (Kir2.1), который стабилизирует потенциал покоящейся мембраны, и повышение экспрессии кальциевого канала L-типа (Cav1.2), улучшая обработку кальция.
  • Т-трубочки образование — Регулярная прокладка способствует развитию поперечных канальцев (t-трубочек), инвагинации сарколеммы, необходимые для быстрого возбуждения-контрактной связи.Т-трубочки в значительной степени отсутствуют в незрелых клетках, но становятся необходимыми для взрослого сокращения.
  • Саркоплазматическая ретикулум созревание — электрическая активность повышает экспрессию рецепторов рианодина и SERCA2a, улучшая цикличность кальция и релаксационную кинетику.
  • Улучшение скорости передачи — Проведение темпов повышает экспрессию белков стыковки зазора, особенно коннексина-43, что приводит к лучшей электрической связи и более быстрому распространению сигнала.

Протоколы и параметры дорожного движения

Эффективность электростимуляции зависит от протокола. Типичные параметры включают в себя **:

  • Частота: 1-3 Гц (60-180 ударов в минуту), соответствующие физиологические частоты сердечных сокращений. Более низкие частоты (0,5 Гц) могут использоваться для культур на ранней стадии, чтобы избежать чрезмерной стимуляции.
  • Напряжение: 2-10 В/см, в зависимости от размера и плотности ткани.Монофазные или бифазные импульсы могут применяться, при этом бифазные формы волн часто уменьшают электролиз и повреждение клеток.
  • Длительность: Было показано, что непрерывная прогулка в течение 1-2 недель дает максимальные преимущества для созревания, хотя более короткие периоды (3-5 дней) все еще могут дать измеримые улучшения.

Важно отметить, что электрическая подложка культуральной среды должна поддерживать эффективную доставку тока. Проводящие каркасы, такие как те, в которых используются углеродные нанотрубки, золотые нанопровода или графен, могут повысить эффективность прокладки путем снижения электрического импеданса.

Ограничения электрической стимуляции в одиночку

Хотя электрическая скорость сильно улучшает электрофизиологические свойства, она не полностью повторяет структурное созревание, вызванное механическими силами. Например, ускоренные ткани часто показывают улучшенные переходные процессы кальция, но все еще могут не иметь выровненных, высокоорганизованных миофибрилл, наблюдаемых в родном взрослом миокарде. Это ограничение мотивировало комбинацию электрических и механических сигналов.

Синергетические эффекты механических и электрических

Учитывая, что сердце одновременно испытывает как механические, так и электрические сигналы, логично, что наиболее выраженное созревание происходит, когда обе модальности применяются вместе. Эта синергия не просто аддитивна — сигналы взаимодействуют на клеточном и молекулярном уровне.

Молекулярное взаимодействие

Механическое растяжение активирует сигнальные каскады, которые модулируют функцию ионных каналов и экспрессию разрывного соединения. И наоборот, электрическая активность может влиять на организацию цитоскелета и экспрессию механочувствительного белка. Например, белок анкирин-B, который прикрепляет ионные каналы к цитоскелету, активируется в ответ как на растяжение, так и на промежуточное движение, предполагая конвергентный путь. Было показано, что одновременное применение циклического растяжения и электрического растяжения увеличивает экспрессию зрелой изоформы связывающего миозин сердца белка-C (cMyBP-C) и способствует более взрослой митохондриальной сети.

Функциональные улучшения в инженерных тканевых системах

Исследования с использованием инженерных тканей сердца (EHT) из кардиомиоцитов, полученных из iPSC, показали, что комбинированная стимуляция дает ткани с FLT:

  • Более высокая сократительная сила (до 5-7 мН/мм2, приближающаяся к значениям сердца взрослого человека).
  • Более равномерное выравнивание саркомера и более длинные длины саркомера.
  • Повышенная скорость проводимости (обычно 25-35 см/с против 10-15 см/с для нестимулированных органов управления).
  • Улучшенная переходная кинетика кальция (быстрый подъем и время распада).
  • Больше сопротивляемости аритмическим триггерам.

Пример: В ходе исследования, проведенного Nunes et al. (2013) в Nature Methods, была использована комбинация электромагнитных полей и механической нагрузки в биореакторе для получения сердечной ткани, которая проявляла зрелые характеристики потенциала действия и сократительные силы, сопоставимые с неонатальной тканью сердца крыс.

Биореактор для двойной стимуляции

Современные биореакторы объединяют как механические, так и электрические входные данные. Типичная конструкция включает:

  • Культурная камера с портами для циркуляции и газообмена.
  • Линейный привод или пневматическая система для применения циклического растяжения (часто при 1 Гц).
  • Два или более углеродных электродов, встроенных в стенки камеры для электрического шага.
  • Датчики измеряют силу ткани и электрическое сопротивление в реальном времени.

Эти передовые системы позволяют исследователям самостоятельно настраивать параметры и наблюдать синергетические эффекты. Остается задача масштабировать эти системы для высокопроизводительного скрининга лекарств или для производства клинических сердечных пластырей.

Применение в кардиотканевой инженерии и моделировании заболеваний

Спроектированная мышца сердца для трансплантации

Одной из конечных целей кардиотканевой инженерии является создание имплантируемых пластырей, которые могут заменить рубцовый миокард после сердечного приступа. Сочетание механического и электрического кондиционирования производит пластыри, которые электрически интегрированы с тканью хозяина и могут способствовать силе поврежденного желудочка. Доклинические исследования на моделях грызунов и свиней показали, что предварительно кондиционированные пластыри улучшают фракцию выброса и уменьшают размер инфаркта. Текущие исследования сосредоточены на масштабировании этих пластырей до размера человека при сохранении структурных и электрических свойств, достигнутых с помощью небольших конструкций.

Скрининг лекарств и тестирование на токсичность

Незрелые кардиомиоциты не точно предсказывают реакции на лекарства, часто приводя к ложным негативам или неспособности обнаружить кардиотоксичность. Зрелые ткани, полученные от комбинированной стимуляции, проявляют фармакологические профили, подобные взрослым. Например, их реакция на β-адренорецепторные агонисты и на препараты, которые продлевают интервал QT (например, дофетилид) близко отражается на интервале первичной желудочковой мышцы человека. Это делает их превосходными кандидатами для доклинических испытаний безопасности, потенциально уменьшая необходимость исследований на животных.

Моделирование наследственных сердечных заболеваний

Технология iPSC позволяет исследователям производить специфические для пациента кардиомиоциты, несущие вызывающие заболевание мутации. Однако эти клетки часто незрелые, маскируя фенотип заболевания. Применение механических и электрических сигналов может разоблачать тонкие электрофизиологические и сократительные аномалии в таких условиях, как синдром длинного QT, гипертрофическая кардиомиопатия и дилатационная кардиомиопатия. Полученные модели позволяют изучать механизмы заболевания и тестировать персонализированные терапевтические средства.

Проблемы и будущие направления

Несмотря на прогресс, значительные препятствия остаются до того, как механически и электрически обусловленные сердечные ткани становятся обычным явлением в клинике или в больших объемах скрининговых трубопроводов.

Масштабируемость и воспроизводимость

Современные биореакторные системы часто создаются на заказ и ограничены небольшим количеством конструкций. Масштабирование производства десятков или сотен однородных тканей для промышленного скрининга лекарств требует стандартизированного оборудования и протоколов. Разработка микрофлюидных платформ, интегрирующих стимуляцию и мониторинг, является перспективным направлением.

Долгосрочная стабильность

Созревающие эффекты механических и электрических сигналов могут наступать или даже меняться после удаления стимуляции. Для поддержания фенотипа у взрослых ткани могут нуждаться в непрерывном кондиционировании или периодической рестимуляции. Исследуется инкапсуляция в гидрогелях, которые медленно высвобождают факторы роста или сохраняют электрические свойства после имплантации.

Неоднородность клеточных источников

Кардиомиоциты, полученные из iPSC, по своей природе являются гетерогенными, содержат смеси желудочковых, предсердных и узловатых клеток. Эта изменчивость влияет на реакцию на стимуляцию. Продвинутые протоколы сортировки клеток и направленной дифференциации улучшают чистоту, но необходима дальнейшая работа для обеспечения равномерной реакции целых тканей.

Интеграция с хостингом

Даже самая зрелая сконструированная ткань выйдет из строя, если она не будет электрически и механически интегрироваться с сердцем реципиента.Стратегии для содействия интеграции включают применение механического предварительного стресса для соответствия жесткости целевой области и покрытие пластыря проводящими полимерами, которые стимулируют образование разрыва на границе.

Заключение

Механические и электрические сигналы являются не только факторами окружающей среды - они являются важными инструкторами созревания сердечной ткани. Воссоздавая растяжение, жесткость и электрическую скорость развивающегося и взрослого сердца, исследователи достигли беспрецедентных уровней структурной и функциональной зрелости in vitro. Синергия между этими сигналами, обусловленная перекрытием механотрансдукции и электрофизиологических путей, является ключом к производству тканей, которые могут точно восстанавливать поврежденные сердца, моделировать болезни и надежно прогнозировать реакции на лекарства.

По мере развития технологии биореакторов и углубления нашего понимания молекулярного перекрестного разговора между силами и сигналами мечта о построении полностью взрослой сердечной мышцы в лаборатории приближается к реальности. В следующем десятилетии, вероятно, будут проведены первые клинические испытания кондиционированных сердечных пластырей, а также интеграция этих зрелых тканей в основные трубопроводы разработки лекарств. На данный момент роль механических и электрических сигналов стоит в качестве краеугольного камня сердечной тканевой инженерии - напоминание о том, что окружающая среда сердца так же важна, как и его генетический план.