Table of Contents

Сосудистые гладкие мышечные клетки являются ключом к функциональным инженерным кровеносным сосудам

Сердечно-сосудистые заболевания остаются ведущей причиной смерти во всем мире, стимулируя постоянный спрос на сосудистые трансплантаты. В то время как аутологичные сосуды, такие как подкожная вена, являются золотым стандартом для шунтирования, многие пациенты не имеют подходящей донорской ткани из-за предшествующего сбора урожая, болезни или анатомических ограничений. Синтетические трансплантаты, сделанные из Dacron или ePTFE, хорошо работают для артерий большого диаметра, но не работают в приложениях малого диаметра (менее 6 мм) из-за тромбоза и интимальной гиперплазии. Тканеинженерные кровеносные сосуды (TEBV) предлагают убедительную альтернативу, сочетая биоразлагаемые каркасы с живыми клетками для создания конструкций, которые могут расти, реконструироваться и интегрироваться с хозяином. Среди клеточных компонентов инженерного сосуда клетки сосудистых гладких мышц (VSMC) выделяются в качестве основных детерминантов механической прочности, сократительной функции и долгосрочной проходимости. Понимание многогранной биологии VSMCs и перевод этих

Что такое сосудистые гладкие мышечные клетки?

VSMCs являются узкоспециализированными, нестриженными мышечными клетками, которые находятся в тунике артерий и вен. В нативных сосудах они существуют в спокойном, сократительном фенотипе, характеризующемся обильными сократительными белками, такими как α-слизистый мышечный актин (α-SMA), гладкая мышечная миозиновая тяжелая цепь (SM-MHC) и кальпонин. Эти клетки реагируют на гемодинамические силы и нейрогуморальные сигналы, сокращаясь и расслабляясь для регулирования диаметра сосуда, артериального давления и регионального кровотока. Однако VSMCs не являются неизлечимо дифференцированными; они сохраняют замечательную фенотипическую пластичность. В ответ на повреждение, факторы роста или изменения внеклеточного матрикса (ECM), они могут переключиться на синтетический или пролиферативный фенотип, подавляя сократительные маркеры и повышая производство ECM, матричные металлопротеиназы и про

Помимо сократимости и синтеза ECM, VSMC также выполняют критическую барьерную функцию. Они помогают регулировать прохождение макромолекулы и клетки через стенку сосуда, способствуют выработке эластичных волокон, обеспечивающих отдачу, и взаимодействуют с эндотелиальными клетками посредством паракринной сигнализации для поддержания сосудистого гомеостаза. В TEBV малого диаметра функциональный слой VSMC часто является разницей между трансплантатом, который остается открытым, и тем, который выходит из строя из-за тромбоза или аневризмы.

Критическая роль VSMC в инженерных кровеносных сосудах

В тканеинженерном кровеносных сосудах VSMCs являются не просто клетками-наполнителями. Они являются архитекторами механических и биологических свойств стенки сосуда. Их роли могут быть разбиты на несколько взаимосвязанных функций.

Сократимость и сосудореактивность

Основным преимуществом живых ТЭБВ перед синтетическими трансплантатами является их способность активно регулировать кровоток. При правильной дифференцировке VSMC в сконструированной стенке могут сокращаться в ответ на агонисты, такие как эндотелин-1, ангиотензин II и хлорид калия, и расслабляться в ответ на оксид азота или простациклин. Эта вазореактивность помогает сопоставлять перфузию с потребностью в тканях и ослаблять пульсовое давление, снижая риск повреждения органов вниз по течению. Исследователи часто измеряют сократительную силу сконструированных сосудов в биореакторах путем перфузии вазоактивными агентами и отслеживания изменений диаметра. Достижение сократительной реакции, сопоставимой с нативными артериями, остается эталоном для созревания ТЭБВ.

Структурная поддержка и производство ECM

Механическая прочность кровеносных сосудов исходит в основном от ECM, секретируемого VSMCs. Коллаген типа I и III обеспечивают прочность на растяжение, в то время как эластин дает сосуду его эластичную отдачу. В инженерных конструкциях VSMCs сеяны на каркас - часто биоразлагаемый полимер, такой как поликапролактон (PCL), полигликольная кислота (PGA) или децеллюляризованная матрица - и затем культивируются в динамических условиях. В течение недель до месяцев VSMCs деградируют каркас и заменяют его своим собственным ECM. Полученная конструкция может развить давление разрыва, превышающее 2000 мм рт.ст. и соответствие, приближающееся к тому из нативных артерий. Без надежной популяции VSMC стенка сосуда остается тонкой и подверженной аневризме или разрыву.

Исцеление, интеграция и ремоделирование

При имплантации ТЭБВ подвергается травме и воспалению. Иммунные клетки хозяина проникают в стенку, и циркулирующие клетки-предшественники могут прижиться. VSMC в конструкции могут размножаться и мигрировать, чтобы повторно заселить области потери клеток, и они производят матрицу для восстановления микросхем. Со временем инженерные сосуды реконструируются, чтобы напоминать родную артерию, при этом VSMC выравнивается по окружности и экспрессирует зрелые сократительные маркеры. Этот процесс ремоделирования необходим для долгосрочной проходимости и является одним из наиболее убедительных аргументов в пользу использования живых клеток, а не бесклеточного каркаса.

Ингибирование тромбоза и интимной гиперплазии

Функциональный слой VSMC также способствует антитромботическим свойствам стенки сосуда. Схемные VSMC производят ингибитор тромбомодулина и тканевого фактора пути, и они поддерживают нетромбогенную поверхность, когда эндотелиальный слой не поврежден или отсутствует. В случаях, когда эндотелий поврежден или отсутствует — обычно в анастомотических участках — основные VSMC могут помочь ограничить активацию тромбоцитов и образование тромбов. Кроме того, VSMC, которые остаются в спокойном фенотипе, с меньшей вероятностью способствуют неоинтимальной гиперплазии, аномальной пролиферации клеток гладкой мышцы, что приводит к сбою трансплантата. Инженерные стратегии, которые способствуют стабильному сократительному фенотипу VSMC, поэтому являются ключевыми для предотвращения как тромбоза, так и гиперплазии.

Источники VSMC для Tissue Engineering

Выбор источника VSMC резко влияет на производительность конечной конструкции.Каждый источник имеет преимущества и ограничения, которые необходимо сопоставить с клинической целью.

Первичные артериальные VSMC

Наиболее прямым источником являются первичные VSMC, выделенные из донорских артерий (например, из остатков внутренней грудной артерии или собственной подкожной вены пациента). Эти клетки уже привержены линии гладкой мышцы и могут быть расширены в культуре. Однако они имеют конечную репликативную продолжительность жизни и могут подвергаться фенотипическому дрейфу в сторону синтетического состояния во время расширения. Для аутологичного использования сбор донорского сосуда является инвазивным и может быть непрактичным у пациентов с сосудистыми заболеваниями. Аллогенные источники рискуют отторжение иммунитета, если реципиент не подавлен или клетки не спроектированы, чтобы уклоняться от иммунной системы.

Стволовые клетки, полученные VSMC

Стволовые клетки обеспечивают масштабируемый и потенциально аутологичный источник VSMCs. Плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs или ESCs) могут быть направлены на судьбу гладкой мышцы с использованием протоколов, включающих факторы роста, такие как PDGF-BB, TGF-β1 и активин A. Полученные VSMC-подобные клетки экспрессируют сократительные маркеры и могут сокращаться in vitro. Мезенхимальные стволовые клетки (MSCs), полученные из костного мозга, жировой ткани или пуповины, также дифференцируются в клетки, подобные гладкой мышце, в соответствующих условиях и обладают преимуществом иммуномодулирующих свойств. Однако эффективность дифференцировки и стабильность фенотипа VSMCs, полученных из стволовых клеток, остаются областями активного исследования. Дифференцировку и опухолевость (в случае iPSCs) необходимо тщательно контролировать.

Внедрение VSMC через прямое перепрограммирование

Возникает подход прямого превращения фибробластов или других соматических клеток в VSMC с использованием линейно-специфических факторов транскрипции, таких как MYOCD (миокардин) и SRF. Этот метод позволяет избежать плюрипотентной стадии и может дать более однородную популяцию. Ранние исследования показывают, что перепрограммированные VSMC могут способствовать образованию сосудов in vivo, но поле все еще доклиническое.

Дизайн каркаса и стратегии культуры

Для использования всего потенциала ВСМС леса должны обеспечивать соответствующую механическую поддержку, биохимические сигналы и скорость деградации, соответствующую осаждению ЭХМ. Используются три широкие категории лесов.

Натуральные леса

Гидрогели коллагена, фибрина и гиалуроновой кислоты обеспечивают отличную биосовместимость и места адгезии клеток. ВСМС, встроенные в эти гели, могут реконструировать их, но начальная механическая прочность низкая. Фибрин успешно используется в нескольких моделях ТЭБВ, включая так называемые «самосборные» листы сосудов, где ВСМС культивируются в фибриновом геле, который они постепенно заменяют на ECM. Процесс занимает недели и требует биореактор для применения циклического растяжения, который повышает регуляции синтеза эластина и коллагена.

Синтетические биоразлагаемые полимеры

Полимеры, такие как PCL, PGA, полимолочной кислоты (PLA) и поли(лактико-ко-гликолевая кислота) (PLGA) могут быть электроспунированы в нановолокнистые сетки, которые имитируют архитектуру нативной ECM. Эти каркасы обеспечивают немедленную механическую прочность и могут быть адаптированы для разложения в течение недель до месяцев. VSMC, посаженные на эти каркасы, прикрепляют, размножают и осаждают ECM. Ключевой задачей является достижение равномерного распределения клеток по всей толщине стенки, особенно в клинически значимых длинах сосудов (5-20 см). Динамические методы посева с использованием вращательных или перфузионных систем улучшают покрытие.

Децеллюляризованные матрицы

Децеллюляризованные сосуды человека или животных сохраняют нативную архитектуру и состав ECM, включая коллаген, эластин и гликозаминогликаны. После удаления клеточных антигенов эти каркасы могут быть рецеллюляризированы с VSMC (и эндотелиальными клетками) для получения «гибридного» сосуда. Рецеллюляризованный сосуд часто проявляет отличные механические свойства и сосудореактивность, но процесс децеллюляризации может повредить компоненты ECM, и полное удаление иммуногенных эпитопов из ксеногенных источников затруднено.

Механическое кондиционирование в биореакторах

Независимо от типа каркаса, динамическая культура почти всегда требуется для производства функционального TEBV. Биореакторы применяют пульсационный поток и циклическое окружное растяжение, которые имитируют гемодинамическую среду нативной артерии. Механические силы активируют сигнальные пути (например, RhoA / ROCK, опосредованная интеграном механотрансдукция), которые способствуют сократительному фенотипу VSMC и стимулируют выравнивание и сшивание ECM. Типичные протоколы включают перфузию с низким потоком в течение первой недели, чтобы обеспечить прикрепление клеток, с последующим увеличением потока и давления в течение 4-8 недель. Результатом является сосуд, который может быть имплантирован хирургическим путем и оставаться патентованным.

Современные проблемы в VSMC-базируемых инженерных судах

Несмотря на значительный прогресс, некоторые препятствия препятствуют широкому клиническому использованию ТЭБВ.

Фенотип стабильности

Единственная самая большая проблема - поддержание сократительного фенотипа VSMC со времени посева через жизнь имплантата. В статической культуре VSMC быстро переключаются в синтетическое состояние и производят чрезмерную матрицу, которая может закрывать просвет (неоинтимальная гиперплазия). После имплантации сосуд подвергается сложной, воспалительной среде, которая может дополнительно стимулировать переключение фенотипа. Стратегии стабилизации сократительного фенотипа включают использование химически определенных сред (низкая сыворотка, добавление гепарина или TGF-β), механическое предварительное кондиционирование и совместное культивирование с эндотелиальными клетками, которые выделяют оксид азота, который помогает поддерживать VSMCs в покое.

Иммунный ответ

Аллогенные или ксеногенные VSMC будут вызывать иммунный ответ, если хозяин не будет подавлен иммунодепрессантом. Даже аутологичные VSMC могут провоцировать воспаление, если они модифицированы (например, путем редактирования генов) или если материал каркаса иммуногенен. Децеллюляризированные каркасы избегают связанных с клетками антигенов, но не имеют живого компонента VSMC. Некоторые группы исследуют «универсальные донорские» VSMC, разработанные для экспрессии иммуноуклоняющих молекул, таких как HLA-E или PD-L1, но эта работа находится на ранних стадиях.

Диффузия питательных веществ и выживание клеток

В толстостенных сосудах (более 200-300 мкм) кислород и питательные вещества не могут достичь внутренних VSMCs путем диффузии. Без функциональной микроваскулатуры клетки в центре стенки могут погибнуть во время культивирования или после имплантации. Стратегии преодоления этого включают совместное культивирование с эндотелиальными клетками, которые образуют капиллярные сети, использование кислород-генерирующих каркасов или создание пористых каркасов, которые позволяют быструю васкуляризацию от хозяина. Некоторые группы исследуют трансплантаты сосудов малого диаметра с предварительно сформированными каналами, которые способствуют врастанию сосуда хозяина.

Масштабируемость и производство

Для производства ТЭБВ, отвечающего нормативным стандартам, требуется воспроизводимый, экономически эффективный производственный процесс. Современные методы часто включают недели расширения клеток и культивирования биореакторов, с ручными этапами, которые являются трудоемкими и склонными к изменчивости. Разработка биореакторов с замкнутой системой, автоматизированное посевное производство клеток и анализы контроля качества (например, для экспрессии сократительных маркеров, давления разрыва) будут иметь важное значение для перевода ТЭБВ в коммерческое производство.

Будущие направления и инновации

Ряд новых технологий призван решить проблемы, описанные выше.

Редактирование генов для контроля фенотипа

Инструменты на основе CRISPR могут использоваться для разработки VSMC, которые устойчивы к фенотипическому переключению или к чрезмерной экспрессии сократительных белков. Например, стучать в конститутивно активном трансгене миокардина или удалять KLF4 (фактор транскрипции, который управляет синтетическим фенотипом) может блокировать VSMC в сократительном состоянии. Аналогичным образом, редактирование генов может производить клетки, которые уклоняются от иммунного распознавания или экспрессируют проангиогенные факторы для содействия интеграции хозяина.

3D биопечать

Биопечать позволяет точно контролировать распределение клеток, состав каркасов и даже ориентацию печатных волокон. Многоосевые струйные или экструзионные принтеры могут наносить слои гидрогелей, нагруженных VSMC, полимерных оболочек и эндотелиальных клеток для построения сосуда с определенной геометрией. Несколько групп напечатали артерии малого калибра с открытыми люменами и продемонстрировали сократительные реакции после культивирования. Задача заключается в достижении механической прочности, необходимой для имплантации, но совместное печать с биоразлагаемыми полимерами может обеспечить решение.

Органоиды и самосборные суда

Альтернативой подходам, основанным на каркасных лесах, является возможность самоорганизации VSMC в структуру сосудов. При культивировании VSMC на трубчатой нижнечелюстной трубе в определенной среде некоторые группы производят клеточные сосуды, которые достаточно прочны для имплантации после децеллюляризации. Другие создали «гладкие мышечные органоиды», которые проявляют спонтанную сократительную активность и могут использоваться для изучения сосудистых заболеваний или тестирования реакции на лекарства.

Клинический перевод и текущие испытания

Несколько платформ ТЭБВ вошли в клинические испытания. Наиболее продвинутым является трансплантат «Линия жизни» (CytoGraft, теперь часть Humacyte), который использует аллогенные VSMC, сеянные на биоразлагаемую основу в биореакторе, затем децеллюляризованный перед имплантацией. Этот клеточный трансплантат содержит богатую ECM, производимую VSMC, но избегает иммуногенности живых клеток. Ранние клинические испытания в доступе к гемодиализу и заболевания периферических артерий показали перспективу, с частотой проходимости, приближающейся к таковой аутологичных вен в некоторых исследованиях. Другие группы исследуют полностью живые трансплантаты с аутологичными клетками, хотя они требуют более специфического производства для пациента.

Для дальнейшего чтения см. этот обзор регулирования фенотипа VSMC и этот обзор кардиологии Nature Reviews тканеинженерных сосудистых трансплантатов . Дополнительные подробности о материалах каркаса можно найти в этой статье о биоматериалах .

Заключение

Сосудистые клетки гладкой мускулатуры — это гораздо больше, чем структурный наполнитель в сконструированных кровеносных сосудах. Они обеспечивают сократительную функцию, которая делает трансплантат отзывчивым к гемодинамическим требованиям, создают и поддерживают внеклеточный матрикс, который придает сосуду механическую целостность, и участвуют в заживлении и ремоделировании после имплантации. Успешный перевод ТЭБВ в клинику зависит от нашей способности надежно получать VSMC, поддерживать их желаемый фенотип во всей культуре и после имплантации и проектировать каркасы, которые поддерживают их функцию. С достижениями в биологии стволовых клеток, редактировании генов, проектировании биореакторов и 3D-биопечати цель производства готовых, прочных сосудистых трансплантатов малого диаметра приближается к реальности. По мере того, как поле продолжает созревать, роль VSMCs останется центральной для каждого прорыва.