Роль эндотелиального выравнивания клеток в конструкции сосудистого каркаса

Топографические сигналы: контактное руководство в трех измерениях

Микро- и наномасштабное моделирование

Клетки исключительно чувствительны к физическим особенностям их субстрата, явлению, известному как контактное наведение. В сосудистых каркасах топографические сигналы могут передаваться через волокна, канавки, гребни или поры. Выровненные нановолокна, в частности, имитируют анизотропную архитектуру нативной внеклеточной матрицы (ECM) сосудистой стенки (медиа туники и адвентиции). Исследования показали, что EC, культивируемые на выровненных нановолокнах, удлиняются и ориентируются параллельно направлению волокна, даже в отсутствие потока. Это предварительное выравнивание может служить «первичным» шагом. Когда поток применяется позже, клетки уже частично ориентированы, сокращая время, необходимое для достижения полностью выровненного, функционального состояния.

Ключевые топографические параметры включают диаметр волокна, расстояние и точность выравнивания. Волокна диаметром от 200 нм до 1 мкм, разнесенные на несколько микрон друг от друга, обеспечивают оптимальные сигналы наведения. Если волокна слишком толстые или широко разнесены, клетки могут распространяться по нескольким волокнам и терять информацию о направлении. И наоборот, волокна, которые слишком плотные, могут ограничивать миграцию клеток и диффузию питательных веществ. Передовые технологии изготовления, такие как электроспиннинг с вращающимся коллектором или электроспиннинг ближнего поля, могут управлять этими параметрами с высокой точностью.

Роль поверхностной грубости и пористости

Помимо выравнивания волокон, шероховатость поверхности на нанометровом масштабе также влияет на выравнивание и адгезию EC. Умеренная шероховатость (Ra ≈ 10-50 нм) способствует кластеризации интегрина и образованию очаговой адгезии, что, в свою очередь, облегчает генерацию и выравнивание цитоскелетного напряжения. Чрезмерная шероховатость, однако, может активировать воспалительные пути или вызывать повреждение клеточной мембраны. Пористость одинаково важна: высоко пористая каркасная оболочка позволяет лучше транспортировать питательные вещества и врастание тканей, но поры, которые слишком велики (> 100 мкм), могут нарушить непрерывность монослоя EC. Должен быть достигнут баланс между стимулированием инфильтрации для регенерации тканей и поддержанием гладкой, сливной световой поверхности для эндотелиализации.

Механическая жесткость и субстратная эластичность

Жесткость каркаса (эластичный модуль) является мощным регулятором поведения EC. Нативные стенки артерий проявляют жесткость примерно 0,5-5 МПа (в зависимости от возраста и состояния заболевания), в то время как синтетические трансплантатные материалы, такие как расширенный политетрафторэтилен (ePTFE), намного жестче (> 100 МПа). Границы, которые близко соответствуют нативной жесткости ткани, способствуют спокойному, выровнённому эндотелиальному фенотипу . На жестких субстратах ECs имеют тенденцию к большему распространению, образуют более крупные очаговые спайки и демонстрируют менее организованную сеть актинов. Они также показывают регулируемые воспалительные маркеры, такие как ICAM-1 и VCAM-1. И наоборот, совместимые субстраты (в диапазоне kPa) предпочитают более округлую, менее выровненную морфологию, которая также не идеальна для выравнивания потока.

Оптимальный диапазон для сосудистого каркаса - жесткость, которая позволяет временное осаждение матрицы и сокращение клеток, обеспечивая при этом достаточную структурную целостность, чтобы противостоять давлению разрыва. Это часто достигается благодаря композитным конструкциям: жесткий внешний слой (например, поликапролактон, PCL) для механической прочности и мягкий внутренний слой (например, желатин, коллаген) для совместимости с ЕС. Градиентная жесткость каркасов, где световая поверхность мягкая и внешняя стенка жесткая, являются новой стратегией, которая может одновременно удовлетворять механическим и биологическим требованиям.

Биохимические сигналы: руководство выравниванием посредством молекулярного распознавания

Топография и жесткость не действуют изолированно; они интерпретируются клетками в согласии с биохимическими сигналами. Идеальный сосудистый каркас представляет собой сложную среду белков ECM (коллаген типа I и IV, фибронектин, ламинин), факторов роста (VEGF, FGF, PDGF) и адгезионных пептидов (RGD, YIGSR). Эти молекулы могут быть иммобилизованы на поверхность каркаса посредством ковалентного связывания, адсорбции или захвата в гидрогелях. Важно отметить, что пространственное представление этих сигналов имеет значение. Например, микропаттернированные линии фибронектина могут направлять выравнивание EC даже на плоских поверхностях , демонстрируя, что биохимические сигналы могут переопределять или дополнять топографические.

Биофункционализация также помогает бороться с одним из основных режимов отказа сосудистых трансплантатов малого диаметра: интимальной гиперплазией. Этот патологический ответ характеризуется чрезмерной пролиферацией клеток гладкой мышцы (SMC) и осаждением ECM. Селективно способствуя адгезии и выравниванию EC, одновременно препятствуя чрезмерному росту SMC (например, через антипролиферативные покрытия или пептиды адгезии, специфичные для EC), каркасы могут поддерживать здоровый баланс и предотвращать сужение трансплантата. Включение антитромботических молекул (гепарин, тромбомодулин) дополнительно улучшает острую проходимость, предотвращая раннее образование сгустков на поверхности каркаса.

Методы изготовления каркасов для контролируемого эндотелиального выравнивания

Электроспиннинг выровненных нанофибр

Электроспиннинг является наиболее широко используемым методом получения выровненных волокнистых каркасов. Сбор вертебренных волокон на высокоскоростной вращающейся мандре (скорость вращения > 1000 об/мин), волокна могут быть ориентированы по окружности, имитируя выравнивание SMC и ECs в нативной стенке сосуда. Параметры процесса (напряжение, расход, концентрация раствора, расстояние выравнивания) позволяют точно настраивать диаметр волокна и степень выравнивания. Материалы, обычно используемые, включают синтетические полимеры (PCL, PLGA, полиуретан) и природные полимеры (коллаген, эластин, шелковый фиброин). Гибридные смеси, такие как PCL / коллаген, сочетают механическую прочность синтетических полимеров с биоактивностью натуральных ECM. Электроспуновые каркасы продемонстрировали отличное выравнивание и удержание EC под потоком in vitro , а несколько исследований на животных показывают хорошую краткосрочную проходимость.

Ограничения электроспиннинга включают ограниченный контроль над осаждением волокон в трех измерениях (растения, как правило, представляют собой тонкие листы или трубки), трудности в создании сложных архитектур пор и потенциал для остаточных токсичных растворителей. Послеобработка, такая как коаксиальное прядение или эмульсионное прядение, может включать факторы роста или препараты для контролируемого высвобождения.

Микрофабрикация и мягкая литография

Для точного контроля над топографическими узорами (резинками, колоннами, каналами) были адаптированы методы микрофабрикации, заимствованные из полупроводниковой промышленности, для производства каркасов. Фотолитография и репликное формование позволяют создавать подложки с характеристиками в диапазоне от 500 нм до 100 мкм. Эти методы идеально подходят для изучения механизмов выравнивания EC в высококонтролируемой среде. Например, было показано, что канавки шириной 2 мкм и глубиной 1 мкм выравнивают EC более эффективно, чем более мелкие канавки. Микрофлюидные каркасы также могут включать микрофлюидные каналы для имитации капиллярных сетей, что позволяет изучать выравнивание EC в условиях контролируемого потока.

В то время как микрофабрикация предлагает беспрецедентную точность, она обычно ограничивается двумерными поверхностями или простыми трехмерными структурами. Подход наиболее полезен для создания моделей сосудистой барьерной функции (например, «сосуд на кристалле»), а не имплантируемых трансплантатов. Однако такие методы, как 3D-печать и двухфотонная полимеризация, начинают преодолевать этот разрыв, позволяя изготавливать каркасы как с микромасштабными выравнивающими сигналами, так и с макромасштабной анатомической формой.

Децеллюляризованные матрицы и природные леса

Альтернативой синтетическим каркасам является использование децеллюляризованных нативных сосудов. Эти каркасы сохраняют сложную архитектуру и ECM-композицию естественных кровеносных сосудов, включая выровненные коллагеновые и эластиновые волокна, которые обеспечивают отличные выравнивающие сигналы для повторно посаженных ECs. Децеллюляризованные каркасы имеют преимущество почти идеального механического соответствия и ранее существовавшей сосудистой базальной мембраны . Однако они несут риски иммуногенности, неполного удаления клеток и потенциальной передачи заболевания. Кроме того, они ограничены доступностью доноров и не могут быть легко масштабированы для массового производства. Несмотря на эти недостатки, децеллюляризованные трансплантаты малого диаметра (например, из человеческих пуповинных вен или свиных артерий) показали многообещающие результаты в ранних клинических испытаниях, особенно в сочетании с аутологичным эндотелиальным посевом.

Оценка выровненных лесов: подходы in vitro и in vivo

Оценка качества эндотелиального выравнивания на каркасе требует как качественных, так и количественных методов. in vitro флуоресцентная микроскопия актиновых нитей (окрашивание фаллоидинами) или VE-кадгериновых соединений может выявить ориентацию клеток. Программное обеспечение для анализа изображений может вычислить индекс выравнивания (например, процент клеток, ориентированных в пределах ±15° предпочтительного направления). Более продвинутые методы включают атомно-силовую микроскопию (AFM) для измерения жесткости и тяговых сил клеток и иммунофлюоресценцию для маркеров покоя (например, KLF2, eNOS) по сравнению с активацией (например, ICAM-1, VCAM-1).