Понимание проблем культуры хряща и костных клеток

Хрящ и костные ткани представляют собой одни из самых грозных препятствий в культуре первичных клеток из-за их уникальных структурных и биохимических свойств. Хрящ, особенно суставный хрящ, является аваскулярным и содержит редкую популяцию хондроцитов, встроенных в плотный внеклеточный матрикс (ECM), богатый коллагеном II типа, аггреканом и протеогликана. Эта матрица не только сопротивляется ферментативному перевариванию, но и ограничивает диффузию питательных веществ, что делает восстановление клеток и последующую пролиферацию серьезной проблемой. Кость, с другой стороны, представляет собой минерализованную ткань, состоящую из кристаллов гидроксиапатита, осаждаемых на коллагеновой каркасе. Наличие кристаллов фосфата кальция требует шагов декальцификации, которые могут поставить под угрозу жизнеспособность клеток, если не тщательно контролировать. Кроме того, обе ткани демонстрируют низкую плотность клеток (хондроциты составляют менее 5% объема хряща, а остеоциты аналогично дефицитны в корковой кости), что означает, что каждая

Стратегии успешной изоляции клеток и культуры

Энзиматическое пищеварение

Краеугольным камнем изоляции клеток от плотных соединительных тканей является ферментативное переваривание. Коллагеназа (типы I, II или смесь) является наиболее широко используемым ферментом, поскольку она разлагает нативные коллагеновые фибриллы, высвобождая захваченные клетки. Для хряща двухступенчатое переваривание часто дает лучшую жизнеспособность: во-первых, кратковременное лечение трипсином или проназой для удаления поверхностных протеогликанов, с последующей длительной инкубацией (4–18 часов) с коллагеназой при низких концентрациях (0,1–0,2% в/в). Для костей используется комбинация коллагеназы и диспазы (нейтральная протеаза) для переваривания как коллагена, так и неколлагеновых белков. Крайне важно оптимизировать концентрацию ферментов и время переваривания для каждого источника ткани; Чрезмерная активность ферментов или чрезмерно длинная инкубация могут лизировать клетки или переваривать рецепторы клеточной поверхности, понижая эффективность прикрепления. Мягкое возбуждение и периодическая три

Декальцификация тканей для костей

Перед ферментативным перевариванием костная ткань должна быть декальцифицирована для смягчения минеральной матрицы. Два основных подхода - хелатирующие агенты (например, EDTA) и кислоты (например, соляная или муравьиная кислота). EDTA при нейтральном рН предпочтительнее для исследований, требующих высокой жизнеспособности клеток, поскольку она хелатирует ионы кальция без повреждения клеточных белков. Типичные протоколы инкубируют фрагменты костей при 0,5 М EDTA (pH 7,4) при 4°C в течение 24-72 часов, ежедневно меняя раствор. Декальцификация на основе кислоты быстрее, но более агрессивна; она часто зарезервирована для гистологического анализа, где жизнеспособность клеток менее критична. После декальцификации размягченная ткань тщательно промывается и затем обрабатывается стандартным ферментативным перевариванием. Исследователи должны контролировать конечную точку путем проверки рентгенографической прозрачности или механической мягкости, чтобы избежать чрезмерной декальцификации, которая может лизировать остеоциты.

Механическая диссоциация и микродиссекция

Для очень маленьких биопсий или когда ферментативное переваривание нецелесообразно, могут использоваться механические методы. Микродиссекция под стереомикроскопом позволяет точно выделить хрящевые стружки или трабекулярные костные щепы, сводя к минимуму загрязнение от окружающих тканей. Последующее фарширование скальпелями создает крошечные экспланты, которые могут быть помещены непосредственно в культуральные посуды (культура эксплантата). Хотя это дает меньше клеток изначально, рост клеток с краев эксплантата может быть значительным в течение 7-14 дней. Механическая диссоциация также может быть объединена с ферментативными процедурами для улучшения восстановления клеток, особенно от фиброкартилевидного или пластинчатого хряща роста.

Использование факторов роста и сигнальных молекул

После выделения хондроциты и остеобласты требуют специфического дополнения фактора роста для размножения и поддержания своего фенотипа. Морфогенетические белки костей (BMP-2, BMP-7) и трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β, особенно TGF-1 и TGF-β3) необходимы для содействия хондрогенезу и остеогенезу. Фактор роста фибробластов-2 (FGF-2) и инсулиноподобный фактор роста-I (IGF-I) часто добавляют для повышения скорости пролиферации и задержки старения. Типичные концентрации варьируются от 1 до 50 нг / мл и сроков добавления; например, TGF-β часто отменяется после раннего расширения для предотвращения гипертрофии. Для культур остеобластов дексаметазон (10-100 нМ), аскорбиновая кислота (50 мкг / мл) и бета-глицерофосфат (10 мМ) являются стандартными компонентами для поддержки минерализации матрицы. Сыворотка (10% сыворотка плода) обеспечивает коктейль неопределенных факторов, но

Оптимизация медиа и приложений для культуры

Выбор среды клеточной культуры непосредственно влияет на поведение клеток. Для хондроцитов распространена модифицированная орлиная среда (DMEM) с высокой глюкозой Dulbecco, дополненная GlutaMAX, несущественными аминокислотами и буфером HEPES. Остеобласты процветают в α-MEM или DMEM с пониженным кальцием, если минерализация должна быть вызвана позже. Концентрация сыворотки и пакетная консистенция имеют решающее значение; некоторые лаборатории используют 20% сыворотку для первого прохода для улучшения прикрепления низкоурожайных образцов. Антибиотики (пенициллин-стрептомицин) и противогрибковые препараты (амфотерицин B) добавляются во время первоначальной изоляции, но должны быть сужены, как только культуры установлены для снижения цитотоксичности. Индикатор pH (фенол красный) включен для визуального мониторинга, но для чувствительных экспериментов, фенольные препараты без красного цвета рекомендуются для предотвращения эстрогенных эффектов.

3D Культурные системы и строительные леса

Двумерная монослойная культура может вызывать дифференцировку хондроцитов (потеря экспрессии коллагена II и аггрекана) и уплощение остеобластов. Трехмерные системы лучше имитируют нативную микросреду. Для поддержания фенотипа часто используются культуры пеллет (центрифугированные клеточные агрегаты), культуры микромассы и гидрогелевая инкапсуляция (агарозная, альгинатная, коллагеновая или гиалуроновая кислота). Биореакторы, применяющие циклическое сжатие или напряжение сдвига жидкости, дополнительно усиливают выработку матрицы и выравнивание клеток. Для костей пористые каркасы из гидроксиапатита, β-трикальциевого фосфата или деминерализованной костной матрицы обеспечивают структурную поддержку и остеопроводящие сигналы. Эти передовые модели культур необходимы для изучения механобиологии и для разработки тканевых трансплантатов.

Контроль качества и характеристика изолированных клеток

После выделения и культивирования необходимо проверить идентичность и чистоту клеток. Для хондроцитов положительные маркеры включают коллаген типа II, аггрекан, SOX9 и белок хрящевой олигомерной матрицы (COMP). Маркеры остеобластов включают Runx2, остерикс, щелочную фосфатазу и остеокальцин. Цитометрия потока, количественная ПЦР и иммунофлуоресценция являются стандартными методами. Жизнеспособность должна быть пересмотрена после каждого прохождения; снижение ниже 70% указывает на стресс. Кариотипирование может контролировать хромосомную стабильность во время длительного расширения. Кроме того, функциональные анализы, такие как алкиевое синее окрашивание для протеогликанов в хондроцитовых гранулах или ализариновое красное окрашивание для отложений кальция в культурах остеобластов, подтверждают, что клетки сохраняют свои специализированные функции.

Общие подводные камни и устранение неполадок

Несколько проблем часто возникают, когда культивирование клеток из хряща и кости. Низкий выход клеток может быть решен путем продления времени пищеварения (в безопасных пределах), с использованием свежих ферментов или комбинирования ферментативных и эксплантных методов. Бактериальное или грибковое загрязнение является постоянной угрозой, особенно при работе с хирургическими образцами; тщательное полоскание в стерильном PBS, содержащем 3× антибиотики, до обработки снижает риски. Дедифференциация хондроцитов часто сигнализируется переходом от полигональных к фибробластной морфологии; использование клеток с низким проходом (P0 или P1), сывороточных или низкосывороточных состояний с факторами роста, и 3D культура может быть преодолена путем покрытия культуральных поверхностей коллагеном I типа, фибронектином или поли-L-лизином.[

Будущие направления и новые технологии

Последние достижения расширяют границы того, что может быть достигнуто с помощью дефицитных клеточных популяций из скелетных тканей. Секвенирование РНК одноклеточных выявило неожиданную гетерогенность среди хондроцитов и остеоцитов, что позволяет использовать более целенаправленные стратегии культуры. Органоидные и микротканевые модели, которые интегрируют несколько типов клеток (хондроциты, остеобласты, эндотелиальные клетки) разрабатываются для изучения остеоартрита и восстановления костей. Микрофлюидные платформы позволяют перфузионную культуру костных и хрящевых эксплантатов, сохраняя жизнеспособность в течение нескольких недель. Инструменты редактирования генов, такие как CRISPR-Cas9, могут быть введены в первичные клетки для изучения функции генов или коррекции мутаций заболеваний. Кроме того, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) направлены на хондрогенные и остеогенные линии, предлагая неограниченный источник клеток для исследований и терапии. Эти инновации обещают преодолеть многие ограничения, присущие культуре первичных

Заключение

Успешное культивирование клеток из хряща и кости требует многогранного подхода, который уважает уникальную биологию этих тканей. Тщательный выбор ферментативных протоколов пищеварения, методов декальцификации, коктейлей фактора роста и культуральных платформ значительно улучшает выход клеток и фенотипическую стабильность. Строгий контроль качества гарантирует, что клетки, используемые в приложениях ниже по течению, являются подлинными и функциональными. Приняв эти стратегии, исследователи могут раскрыть потенциал моделей скелетных клеток для продвижения регенеративной медицины, тестирования лекарств и фундаментального понимания опорно-двигательных заболеваний. Продолжение инноваций в 3D-культуре, системах орган-на-чипе и технологии стволовых клеток еще больше расширит нашу способность изучать эти сложные, но жизненно важные ткани (обзор в Curr. Osteoporos. Rep.] .

Для подробных протоколов по ферментативному пищеварению см. Сборник природных протоколов ; для руководящих принципов по фактору роста обратитесь к Переводной медицине стволовых клеток ; а для методов декальцификации обратитесь к Пубмед-индексированным методам .