Table of Contents

Введение

Переход от модели с одним размером подходит для всех представляет собой один из самых значительных достижений в современной медицине. Центральное место в этой трансформации занимает способность культивировать клетки, полученные от пациента - клетки, взятые непосредственно из ткани, опухоли или крови человека - и поддерживать их в лабораторных условиях. Эти клетки служат живыми аватарами болезни пациента, предлагая беспрецедентные возможности для изучения патофизиологии, прогнозирования лекарственных реакций и адаптации лечения с высокой точностью. Однако успешное культивирование клеток, полученных от пациента, не тривиально; это требует тщательной оптимизации условий для сохранения нативных характеристик клеток, обеспечения жизнеспособности и поддержки функциональных анализов. В этой статье излагаются надежные стратегии культивирования клеток, полученных от пациента, от источников и обработки до передовых систем культуры, контроля качества и приложений в персонализированной медицине.

Клетки, полученные от пациентов, включают в себя широкий спектр типов клеток: раковые клетки из биопсии, циркулирующие опухолевые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), мезенхимальные стволовые клетки и иммунные клетки, такие как Т-клетки или естественные клетки-киллеры. Каждый тип представляет уникальные проблемы и требует адаптированных протоколов культуры. Общая цель состоит в том, чтобы максимально точно воспроизвести клеточную среду in vivo, тем самым обеспечивая надежные экспериментальные результаты, которые могут направлять клинические решения. По мере того, как персонализированные методы лечения становятся более распространенными, освоение этих стратегий культуры имеет важное значение для исследователей, клиницистов и биопроизводителей.

Поиск и обработка клеток, полученных от пациентов

Приобретение и обработка тканей

Путешествие клеток, полученных от пациента, начинается с приобретения биологического материала. Ткани обычно получают путем хирургических резекций, биопсии сердечников иглы или забора крови. Качество и клеточный состав исходного материала сильно влияют на успех культуры. Строгая координация между хирургическими командами, патологами и персоналом лаборатории необходима для минимизации ишемического времени и сохранения жизнеспособности клеток. Образцы должны быть немедленно помещены в транспортную среду - часто стерильный солевой раствор, дополненный антибиотиками и противогрибковыми агентами - и храниться на льду или при 4 ° C до обработки. Для хрупких клеток, таких как инфильтрационные лимфоциты опухоли, может потребоваться быстрый транспорт в специализированных средах, содержащих сыворотку или факторы роста.

Этические соображения также играют роль; все сборы тканей должны следовать протоколам институционального совета по обзору и руководящим принципам информированного согласия. Правильная маркировка, деидентификация и отслеживание через штрих-коды или базы данных обеспечивают прослеживаемость и соблюдение правил. После того, как в лаборатории ткань проверяется, взвешивается и фотографируется, если это необходимо, прежде чем приступить к диссоциации.

Клеточная диссоциация и очистка

Для получения одноклеточных суспензий, пригодных для культивирования, твердые ткани должны быть диссоциированы. За механическим минированием скальпелями или ножницами следует ферментативное переваривание. Общие ферменты включают коллагеназу, диспазу, трипсин или комбинацию, в зависимости от типа ткани. Например, коллагеназа IV типа широко используется для опухолевых тканей, поскольку она переваривает внеклеточный матрикс при сохранении эпителиальных и стромальных клеток. Время инкубации и концентрации ферментов должны быть оптимизированы, чтобы избежать переваривания, которое может повредить рецепторы клеточной поверхности или снизить жизнеспособность. Нежное возбуждение или вращение во время пищеварения улучшает контакт.

После пищеварения клеточную суспензию фильтруют через сетчатые сетчатки (например, 100 мкм или 70 мкм) для удаления агрегатов, а затем промывают. Красные кровяные клетки могут быть лизированны буфером аммония-хлорида-калия, если это необходимо. Для дальнейшей очистки такие методы, как центрифугирование градиента плотности, сортировка клеток с магнитной активацией (MACS) или сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS) позволяют изоляцию определенных типов клеток на основе размера, гранулярности или поверхностных маркеров. Этот шаг имеет решающее значение для удаления нежелательных клеток, таких как фибробласты или иммунные клетки, которые могут перерасти популяцию клеток-мишеней. Например, при культивировании опухолевых клеток, полученных у пациента, истощение CD45 + лейкоцитов часто улучшает обогащение опухолевых клеток.

Основополагающие стратегии культуры

Оптимизация медиа и добавок в культуре

Выбор культуральной среды, возможно, является наиболее важным фактором для роста клеток, полученных от пациента. Обычно используются базальные среды, такие как DMEM, RPMI-1640 или расширенный DMEM/F12, но они должны быть соответствующим образом дополнены. Сыворотка (пищевая бычья сыворотка, часто на 5-20%) обеспечивает факторы роста, гормоны и факторы привязанности, но вариабельность от партии к партии может влиять на воспроизводимость. Для приложений, требующих определенных условий, предпочтительны сывороточные или ксено-свободные среды, дополненные рекомбинантными белками (например, EGF, FGF-2, инсулин, трансферрин) и специфические питательные вещества. Для культур стволовых клеток определенные среды, такие как mTeSRTM1 или Essential 8TM, необходимы для поддержания плюрипотентности.

Для раковых клеток, полученных от пациента, добавки с гидрокортизоном, холерным токсином (для стимуляции cAMP) и определенными липидами могут усиливать пролиферацию и поддерживать эпителиальную морфологию. Кроме того, антибиотики (пенициллин-стрептомицин) и антимикотики (амфотерицин B) стандартно добавляются первоначально для предотвращения микробного загрязнения, хотя долгосрочное использование не рекомендуется из-за потенциального клеточного стресса или отбора. pH среды должен тщательно контролироваться; большинство клеток млекопитающих процветают при pH 7.2-7.4, поддерживается буферной системой бикарбоната-CO2 в инкубаторе CO2 5-10%.

Поддержание физико-химических параметров

Помимо среднего состава, условия физической культуры сильно влияют на здоровье клеток. Постоянная температура (37 ° C), влажность (> 95%) и уровни O2 имеют решающее значение. Многие клетки, полученные из пациентов, особенно из гипоксических опухолевых сред, получают выгоду от низкого напряжения кислорода (2-5% O2), а не от атмосферных 20% O2. Это требует инкубатора три-газ, способного контролировать как CO2, так и O2. Кроме того, культуральный субстрат имеет значение: стандартный тканевой культуральный пластик может быть адекватным для клеток-прилипников, но многие клетки, полученные из тканей, требуют покрытия белками внеклеточного матрикса, такими как коллаген, фибронектин, ламинин или Matrigel, для содействия прикреплению и поддержанию дифференциации. Например, эпителиальные клетки молочной железы, культивируемые на блюдах с коллагеновым покрытием, демонстрируют более нормальный морфогенез.

2D против 3D систем культуры

Традиционные двумерные (2D) монослойные культуры на плоском пластике десятилетиями были рабочей лошадкой клеточной биологии, но они часто не воспроизводят сложную архитектуру и клеточные взаимодействия, обнаруженные в тканях. Для клеток, полученных из пациентов, трехмерные (3D) системы культуры появились в качестве превосходных альтернатив, обеспечивая более физиологически релевантные микросреды. Выбор между 2D и 3D зависит от конкретного вопроса исследования и типа клетки. Для быстрого скрининга лекарств и высокопроизводительных анализов 2D-культур может быть достаточно, но для изучения инвазии, ангиогенеза или лекарственной устойчивости необходимы 3D-модели.

Сфероиды и органоиды

Сфероиды представляют собой простые 3D-агрегаты, образующиеся культивирующими клетками в непривязанных условиях, часто в ультранизких пластинах прикрепления или подвесных каплях. Они особенно полезны для изучения роста опухоли, градиентов гипоксии и проникновения лекарств. Органоиды, с другой стороны, представляют собой более сложные самоорганизующиеся структуры, полученные из стволовых или клеток-предшественников, которые повторяют ключевые особенности исходной ткани, включая клеточное разнообразие и тканеспецифическую архитектуру. Органоиды, полученные от пациентов (PDO), были успешно установлены для многих видов рака (например, колоректальные, поджелудочные, предстательная железа, грудь) и в настоящее время являются краеугольным камнем персонализированной онкологии. Органоидная культура требует специализированной среды, богатой факторами роста (R-спондин, Noggin, Wnt-3A) и внеклеточной матриксной поддержки, такой как Matrigel . Протоколы для PDO доступны из таких источников, как Nature Protocols [[FLT

Эшафот и биоматериалы

Для клеток, требующих большей структурной поддержки, подходы к каркасу с использованием природных или синтетических биоматериалов позволяют точно контролировать микросреду. Децеллюляризированный внеклеточный матрикс (dECM), полученный из нативных тканей, обеспечивает биохимические сигналы, в то время как синтетические гидрогели на основе полиэтиленгликоля (PEG), альгинат или гиалуроновая кислота обеспечивают настраиваемую жесткость, пористость и скорость деградации. Эти системы особенно ценны для изучения взаимодействий клеточной матрицы и для инженерных тканей для регенеративной медицины. Технологии биопечати теперь позволяют строить многоклеточные 3D-конструкторы с определенной пространственной организацией, открывая возможности для более прогнозирующих моделей заболеваний.

Обеспечение качества и генетической стабильности

Генетические дрейфы и проходные ограничения

Клетки, полученные от пациентов, не бессмертны; в отличие от стандартных клеточных линий, они имеют конечную продолжительность жизни в культуре и склонны к генетическому дрейфу, если проходят слишком много раз. Повторяющаяся субкультура может выбирать для небольших субпопуляций, которые растут быстрее, что приводит к потере исходного фенотипа и геномных изменений. Поэтому крайне важно ограничить числа проходов - обычно до менее 10 проходов для первичных клеток - и использовать материал раннего прохода для ключевых экспериментов. Для долгосрочных исследований рекомендуется криоконсервация на ранних проходах, с банками флаконов, хранящихся в жидком азоте. Для стволовых клеток необходим тщательный мониторинг кариотипа и маркеров плюрипотентности, поскольку даже iPSC могут приобретать хромосомные аберрации с течением времени.

Анализы контроля качества

Рутинный контроль качества (QC) гарантирует, что клетки, полученные от пациента, остаются репрезентативными для донора. Базовый QC включает в себя проверку морфологии, оценку жизнеспособности (трипановое синее исключение, автоматизированные счетчики) и тестирование микоплазмы с помощью ПЦР или ферментативного детектирования. Для генетической валидации может быть проведено короткое тандемное повторение (STR) профилирования, которое может аутентифицировать клеточную линию и подтвердить идентичность донора. Кариотипирование или сравнительная геномная гибридизация массива (aCGH) может обнаружить крупномасштабные хромосомные изменения. Для функционального QC могут потребоваться анализы потенциала дифференциации (для стволовых клеток) или опухолевой энтероцитов (для раковых клеток). Многие лаборатории принимают руководящие принципы от таких организаций, как ATCC для реализации надежных протоколов генетической стабильности.

Функциональная оценка и применение

Тест на чувствительность к наркотикам

Одним из наиболее прямых применений клеточных культур, полученных от пациента, является тестирование чувствительности к лекарственным средствам ex vivo. Путем воздействия культивируемых клеток - часто в формате 3D органоидов - на панель клинически значимых лекарств исследователи могут определить, какие агенты наиболее эффективны для этого конкретного пациента. Эти анализы могут быть выполнены в 384-луночных пластинах с использованием считывания жизнеспособности (например, CellTiter-Glo, обнаружение АТФ) или высоко содержательная визуализация. Результаты часто коррелируют с клиническими результатами, позволяя онкологам расставлять приоритеты вариантов лечения, особенно когда существуют множественные методы лечения. Национальный институт рака подчеркивает роль такого подхода в точной онкологии.

Персонализированное планирование лечения

Помимо скрининга на лекарственные средства, культуры, полученные от пациентов, могут информировать о решениях о лечении в режиме реального времени. Например, органоиды из биопсии рака прямой кишки использовались для прогнозирования ответа на химиорадиотерапию, направляя решения по хирургическому вмешательству против стратегий ожидания. В иммунотерапии полученные пациентом опухолевые инфильтрационные лимфоциты (TIL) могут быть расширены ex vivo и повторно влиты, в то время как опухолевые органоиды могут использоваться для тестирования блокаторов иммунных контрольных точек в кокультуре с аутологичными Т-клетками. Способность интегрировать геномные данные с функциональными результатами из культивируемых клеток дополнительно повышает точность - мутации, идентифицированные секвенированием следующего поколения, могут быть коррелированы с чувствительностью к лекарствам, наблюдаемой в лаборатории.

Моделирование заболеваний и открытие биомаркеров

Клетки, полученные от пациентов, также служат мощными инструментами для понимания механизмов заболевания. Сравнивая культуры пациентов с различным генетическим фоном или стадиями заболевания, исследователи могут идентифицировать биомаркеры прогрессирования или резистентности. Например, нейроны, полученные из iPSC, у пациентов с амиотрофическим боковым склерозом (ALS), перекапитулируют ключевые патологические особенности и используются для тестирования новых терапевтических средств. Аналогичным образом, органоиды, полученные у пациентов из клеток дыхательных путей кистозного фиброза, позволили провести функциональные анализы модуляторов CFTR, что привело к персонализированному лечению людей с редкими мутациями. Эти модели уменьшают зависимость от тестирования на животных и предоставляют данные, относящиеся к человеку, которые могут ускорить разработку лекарств.

Проблемы в клиническом переводе

Загрязнение и микоплазма

Несмотря на все усилия, загрязнение остается частым препятствием. Бактериальные, дрожжевые и грибковые инфекции могут разрушать культуры, происходящие из образцов тканей или лабораторных реагентов. Микоплазма, в частности, коварна - она не вызывает видимой мутности, но изменяет поведение клеток, метаболизм и экспрессию генов. Регулярное тестирование (ежемесячно) и строгая асептическая техника не подлежат обсуждению. Использование антибиотиков в долгосрочной культуре не рекомендуется, поскольку оно может маскировать инфекции низкого уровня и способствовать резистентности; вместо этого, загрязнения должны быть решены с помощью конкретных методов лечения, если это возможно, или культура отбрасывается и заменяется из замороженных запасов.

Клеточная неоднородность и селекция

Ткани пациента по своей природе гетерогенные, содержащие несколько типов клеток - опухолевые клетки, иммунные клетки, стромальные фибробласты, эндотелиальные клетки и другие. Условия культуры часто благоприятствуют подмножеству, что приводит к потере клеточного разнообразия. Например, стандартные культуры раковых клеток могут быть перехвачены быстро размножающимися фибробластами, если эпителиальные специфические условия не применяются. Такие методы, как сортировка FACS для поверхностных маркеров или селективных сред (например, низкий уровень кальция для кератиноцитов) могут смягчить это, но некоторая гетерогенность желательна, потому что она отражает оригинальную микросреду опухоли. Балансирование обогащения с сохранением разнообразия является проблемой, которая требует тщательного проектирования протоколов культуры.

Масштабируемость и стоимость

Для широкого клинического использования клеточные культуры, полученные от пациента, должны быть масштабируемыми, воспроизводимыми и экономически эффективными. Производство достаточных клеток для высокопроизводительных экранов лекарств или для терапевтической инфузии (например, CAR-T-клеток) требует больших объемов культуры и автоматизированных платформ. Многие текущие протоколы полагаются на дорогостоящие компоненты среды (например, рекомбинантные факторы роста, Matrigel), которые не поддаются крупномасштабному производству. Продолжаются усилия по разработке более дешевых определенных сред и синтетических каркасов. Кроме того, изменчивость между донорами и в пределах одной культуры с течением времени усложняет стандартизацию. Область движется к более надежным протоколам и мерам контроля качества, как подчеркивается в обзорах по проблемам в производстве клеточной терапии .

Будущие направления

Автоматизация и высокопроизводительные системы

Роботизированные обработчики жидкостей, автоматизированные инкубаторы и высококонтентные системы визуализации все чаще интегрируются в рабочие процессы для клеточной культуры пациента. Эти системы сокращают практическое время, улучшают воспроизводимость и позволяют параллельную обработку многих образцов. Например, автоматизированные платформы органоидной культуры могут сеять, кормить и снимать тысячи органоидов в многолуночных пластинах, что позволяет систематически проводить скрининг лекарств в группах пациентов. Такая автоматизация имеет решающее значение для перевода персонализированных методов лечения из исследований в клиническую практику, где время и консистенция имеют значение.

Микрофлюидные платформы и кокультуры

Микрофлюидика обеспечивает точный контроль над клеточной микросредой в микромасштабе, позволяя перфузии, генерации градиента и пространственной компартментализации. Эти устройства могут совместно культивировать опухолевые клетки пациента с иммунными клетками, эндотелиальными клетками или микробными компонентами для моделирования сложных взаимодействий, таких как опухолево-иммунная динамика или проникновение лекарств. Системы орган-на-чипе дополнительно повторяют многоорганные перекрестные контакты, и при засеянии с клетками пациента они обещают персонализированные фармакокинетические и фармакодинамические исследования.

Интеграция с геномикой и ИИ

Следующим рубежом является синергия между культурами клеток, полученных от пациента, геномным профилированием и искусственным интеллектом (ИИ). Большие наборы данных с экранов лекарств могут использоваться для обучения моделей машинного обучения, которые предсказывают реакции лекарств от геномных особенностей, потенциально снижая потребность в функциональном тестировании в каждом случае. И наоборот, изображения органоидной морфологии могут быть проанализированы алгоритмами глубокого обучения для классификации чувствительности к лекарствам или генетических подтипов. По мере роста биобанков культур, полученных от пациента, они становятся бесценными ресурсами для обучения этих моделей, приводя к добродетельному циклу между экспериментированием и вычислительным прогнозированием.

Заключение

Культивирование клеток, полученных от пациента, является основополагающей технологией для персонализированной терапии, позволяющей клиницистам и исследователям захватывать уникальную биологию болезни человека. Оптимизируя источники, состав среды и системы 3D-культуры, и обеспечивая строгий контроль качества, можно поддерживать клетки, которые добросовестно представляют состояние пациента. Такие проблемы, как загрязнение, гетерогенность и масштабируемость, остаются, но новые инструменты в автоматизации, микрофлюидике и искусственном интеллекте обещают преодолеть эти препятствия. По мере того, как эти стратегии созревают, клеточные культуры, полученные от пациента, станут еще более неотъемлемыми для разработки эффективных, индивидуальных методов лечения в онкологии, регенеративной медицине и за ее пределами. Конечная цель - предоставление правильной терапии правильному пациенту в нужное время - зависит от нашей способности надежно культивировать эти клетки и использовать их для руководства клиническими решениями.