Стратегии содействия эндотелиализации сосудистого каркаса

Сосудистые каркасы являются инженерными структурами, предназначенными для руководства регенерацией кровеносных сосудов. Среди наиболее важных детерминант долгосрочного успеха трансплантата является создание функционального эндотелиального слоя на поверхности каркаса. Эндотелиализация — процесс, посредством которого эндотелиальные клетки (ЭК) прилипают, размножаются и образуют сливной монослой — непосредственно влияет на тромбогенность, проходимость и интеграцию с тканью хозяина. Без быстрого и стабильного эндотелиального покрытия синтетические и тканеинженерные сосудистые трансплантаты склонны к раннему отказу от тромбоза и позднему отказу от интимальной гиперплазии. В этой статье описываются ключевые стратегии для содействия эндотелиализации, от поверхностной химии и топографии до доставки биоактивных факторов и посева клеток, и рассматриваются новые технологии, которые обещают приблизить полностью функциональные сосудистые трансплантаты к клинической реальности.

Важность эндотелиализации в сосудистые графты

Эндотелий — динамический, метаболически активный барьер, регулирующий гемостаз, воспаление и тонус сосудов. В нативных артериях ЕК вырабатывают антитромботические молекулы, такие как простациклин и оксид азота, предотвращают адгезию лейкоцитов и контролируют пролиферацию клеток гладкой мускулатуры. При имплантации сосудистой каркаса подкладка подвергает основной материал крови, вызывая активацию тромбоцитов и каскады коагуляции. Даже временное воздействие может образовывать сгусток семян и приводить к острой окклюзии. Со временем отсутствие покрытия ЕК также стимулирует чрезмерную миграцию клеток гладкой мускулатуры и отложение внеклеточного матрикса, проявляясь как интимальная гиперплазия и возможный стеноз трансплантата.

Смешанный эндотелий выполняет три основные функции: он обеспечивает нетромбогенную поверхность, контактирующую с кровью, регулирует проницаемость стенки сосуда и секретирует паракринные сигналы, которые поддерживают гомеостаз сосуда. Таким образом, любая стратегия, которая ускоряет и стабилизирует эндотелиализацию сосуда, может значительно улучшить проходимость трансплантата, особенно в приложениях малого диаметра (<6 мм), где динамика потока менее благоприятна и риск тромбоза является самым высоким. Клинические и экспериментальные данные последовательно показывают, что трансплантаты с более быстрой эндотелиализацией демонстрируют более низкие показатели окклюзии, снижение инфекции и лучшие долгосрочные результаты.

Ключевые стратегии для содействия эндотелиализации

Подходы к повышению эндотелиализации затрагивают каркасно-кровный интерфейс на нескольких уровнях - от пассивных свойств материала до активных биологических вмешательств. Наиболее эффективные стратегии часто объединяют несколько из следующих тактик для создания благоприятной микросреды для присоединения, миграции и распространения.

Модификация поверхности с биоактивными покрытиями

Покрытие просвета каркаса молекулами, имитирующими нативный внеклеточный матрикс (ECM) или непосредственно взаимодействующими с интегранами EC, является широко исследованной стратегией. Общие покрытия включают:

Биомиметические материалы и природные ECM-кафедры

Вместо покрытия синтетического полимера, сам каркас может быть изготовлен из материалов, которые близко напоминают нативный ECM. Децеллюляризированные сосудистые матрицы сохраняют нативную архитектуру, включая мембрану фундамента и резервуар фактора роста, обеспечивая идеальный шаблон для эндотелиализации. Синтетические биомиметические полимеры, такие как поликапролактон (PCL), смешанные с эластичным или коллагеновым полиуретанами, которые имитируют эластичность ECM, могут быть адаптированы для соответствия механическим свойствам нативных артерий, предлагая поверхностные химические вещества, которые способствуют адгезии EC. Электроспиннинг этих материалов производит нановолокнистые каркасы, которые дополнительно имитируют фибриллярную структуру ECM, усиливая наведение и прикрепление клеток.

Фактор роста и контролируемый выпуск

Обеспечение правильных факторов роста в нужное время является мощным способом ускорения эндотелиализации. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) является основным стимулятором пролиферации, миграции и образования трубок. Базовый фактор роста фибробластов (bFGF) и фактор роста тромбоцитов (PDGF) также играют вспомогательную роль. Стратегии доставки включают:

Недавние обзоры показали, что, хотя VEGF является мощным, высокие местные концентрации могут привести к протекающим, порокам развития сосудов. Профили контролируемого высвобождения, которые имитируют естественные временные сигналы, такие как первоначальный всплеск, за которым следует устойчивый низкоуровневый выпуск, имеют тенденцию производить более функциональный эндотелий. Исследования с использованием наночастиц PLGA, загруженных VEGF, в электроспун-каркасах PCL показали полную эндотелиализацию в течение 14 дней в модели сонной кролика .

Сеяние клеток и пред-эндотелиализация

Предварительное посевное каркасное полотно с аутологичными эндотелиальными клетками перед имплантацией является одним из наиболее прямых методов достижения полной эндотелиализации. Клетки можно собирать из небольшой биопсии собственной вены пациента или из стволовых клеток жирового происхождения, дифференцированных в эндотелиальные клетки. Методы посева должны обеспечивать равномерное распределение и сильную адгезию. Динамическое посевное в вращающемся биореакторе или в условиях потока дает более однородное покрытие, чем статическое посевное. После посева конструкция может быть предварительно кондиционирована под пульсативным потоком для выравнивания ECs в направлении потока, повышения регуляции генов, реагирующих на сдвига, и снижения риска отслоения клеток при имплантации.

Ограничения посева клеток включают необходимость второй хирургической процедуры для сбора клеток, время, необходимое для расширения клеток в культуре (обычно 2-4 недели), и риск загрязнения или дифференциации. Для решения этих проблем исследователи разрабатывают «готовые» аллогенные линии EC, которые являются гипоиммуногенными, например, спроектированные с отсутствием молекул MHC II класса, или с использованием эндотелиальных колониеобразующих клеток (ECFC), полученных из пуповинной крови, которые могут быть криоконсервированы и оттаивались по требованию. Недавнее исследование показало, что сосудистые трансплантаты с семенем ECFC малого диаметра достигли скорости проходимости > 90% в модели свиней через 6 месяцев .

Поверхностная топография и микро-/нано-паттернирование

Эндотелиальные клетки очень чувствительны к физическим особенностям подложки. Топографические сигналы на микро- и наноуровне могут направлять выравнивание клеток, усиливать образование очаговой адгезии и способствовать миграции. Методы создания таких особенностей включают:

Важно отметить, что, хотя шероховатые поверхности могут усиливать адгезию к EC, они также увеличивают активацию тромбоцитов, если поры больше ~ 5 мкм или если геометрия шероховатости захватывает тромбоциты.

Механическое кондиционирование и гемодинамическое моделирование

Механическая среда трансплантата глубоко влияет на эндотелиализацию. Нативные EC реагируют на сдвиговый стресс путем удлинения, выравнивания и повышения регуляции антитромботических генов. Имплантированные каркасы, которые очень совместимы, могут вызывать аномальные структуры потока, которые задерживают эндотелиализацию и способствуют интимальной гиперплазии. Стратегии имитировать физиологическую гемодинамику включают:

Новые технологии и будущие направления

Следующее поколение сосудистых каркасов, вероятно, будет интегрировать несколько сигналов - химические, топографические, механические и биологические - с помощью пространственно-временного контроля.

Нанотехнологии и наноносители

Наночастицы могут доставлять биоактивные молекулы с высокой точностью. Например, мезопористые наночастицы кремнезема, загруженные VEGF, могут высвобождать фактор роста в ответ на изменения pH, которые происходят во время воспаления, обеспечивая целенаправленное высвобождение на ранних стадиях заживления ран. Аналогичным образом, донорские наночастицы азота могут локально поставлять эту критическую антитромботическую молекулу, способствуя как эндотелиализации, так и вазодилатации. Нанотопография, созданная углеродными нанотрубками или листами оксида графена, также может использоваться для настройки выравнивания и пролиферации EC посредством электрической стимуляции, поскольку EC реагируют на низкоуровневые электрические поля путем миграции к катоду (галванотаксис).

3D биопечать и специальные для пациентов строительные леса

Аддитивное производство позволяет изготавливать каркасы с контролируемой пористостью, иерархической архитектурой и композиционными градиентами. 3D-биопечать может одновременно депонировать живые клетки, факторы роста и биоматериалы, создавая конструкции, которые содержат предваскуляризованные каналы. Используя данные визуализации для конкретного пациента, можно напечатать каркас, который точно соответствует размерам целевой артерии, обеспечивая оптимальную гемодинамику. Биопечать также позволяет включать перфузионные микроканалы, которые могут быть выстланы с помощью ECs, служа шаблоном для быстрого анастомоза и кровотока. Недавняя работа биопечатала сосудистый трансплантат малого диаметра с двухслойной структурой: внешний слой клеток гладких мышц в желатиновых метакрилоиле и внутренний слой ECs в чернилах фибрин-гиалуроновой кислоты, достигая >95% эндотелиального покрытия после 7 дней перфузионной культуры .

Умные биоматериалы и реагирующие субстраты

Материалы, реагирующие на стимулы окружающей среды, такие как рН, температура, ферменты или свет, обеспечивают динамический контроль над эндотелиализацией. Например, термочувствительные полимеры, такие как поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), могут использоваться для создания поверхности, которая переключается с адгезива на неадгезив при температуре тела, позволяя контролировать сбор листа клетки для слоистых конструкций. Фермент-реактивные гидрогели могут быть разработаны для высвобождения VEGF только тогда, когда матричные металлопротеиназы (ММР), секретируемые мигрирующими EC, деградируют гель, обеспечивая авторегуляторную петлю обратной связи. Такие системы могут предотвращать передозировку факторов роста, гарантируя, что высвобождение совпадает с вторжением клеток.

Генная терапия и эпигенетическая модуляция

Доставка генов проэндотелиализации непосредственно в клетки, выстилающие каркас, представляет собой многообещающую альтернативу. Использование вирусных векторов (например, аденовируса, лентивируса) или невирусных наночастиц для трансфекции ECs или EPCs с помощью VEGF, eNOS (эндотелиальной оксида азота синтазы) или факторов транскрипции, таких как KLF2, может производить устойчивую экспрессию белков, которые способствуют эндотелиализации. Эпигенетические модификаторы, такие как ингибиторы гистоновых деацетилаз, также могут использоваться для повышения регуляции генов, специфичных для EC, и улучшения функции посевных клеток. Однако проблемы безопасности в отношении нецелевых эффектов и долгосрочной экспрессии остаются областями активных исследований.

Проблемы и соображения

Несмотря на богатство стратегий, перевод методов эндотелиализации со скамейки на кровать сталкивается с несколькими препятствиями. Идеальная стратегия должна быть масштабируемой, экономически эффективной и совместимой с нормативными требованиями. Многие методы модификации поверхности сложны и трудно воспроизводимы в клинических условиях. Предварительное посев с аутологичными клетками ограничено наличием донорской ткани и временем, необходимым для расширения клеток. В то время как захват EPC in situ, в то же время, проще, зависит от собственных циркулирующих чисел EPC пациента, которые уменьшаются у пожилых или диабетических пациентов - именно популяция, которая больше всего нуждается в сосудистых трансплантатах.

Еще одной проблемой является баланс между стимулированием роста ЕК и ингибированием пролиферации клеток гладкой мышцы. Многие факторы роста и адгезионные пептиды, которые стимулируют ЕК, также активируют клетки гладкой мышцы, потенциально ухудшая интимальную гиперплазию. Разработка стратегий с истинной селективностью клеточного типа остается приоритетной. Кроме того, должна быть продемонстрирована долгосрочная стабильность эндотелиального слоя при физиологическом сдвигающем стрессе и циклическом механическом напряжении. В естественных условиях животные модели, хотя и информативны, могут не полностью предсказать реакцию человека, и перед клиническими испытаниями необходимы более крупные исследования на животных.

Интеграция нескольких стратегий для достижения оптимальных результатов

Ни один подход не может достичь быстрой, стабильной и полной эндотелиализации во всех клинических сценариях. Скорее, наиболее успешные трансплантаты будут сочетать комплементарные стратегии. Например, каркас, изготовленный из биомиметической полиуретановой смеси, с выровненными нановолокнами, ковалентно иммобилизованным гепарином и медленно высвобождающейся формулой VEGF, может одновременно обеспечивать топографическое руководство, антикоагулянтную активность и митогенную стимуляцию. Предварительное посевное строительство, которое каркас с аутологичными ЭКФК и предварительная кондиционирование под пульсативным потоком, может производить трансплантат, который готов функционировать сразу после имплантации. Исследования в таких интегрированных системах продолжаются, и ранние результаты обнадеживают.

Взгляд в будущее

Область сосудистой тканевой инженерии движется к умным, специфичным для пациента трансплантатам, которые активно участвуют в их собственной интеграции. Достижения в вычислительном моделировании, биосенсорном анализе в реальном времени и системах высвобождения с контролируемой обратной связью позволят будущим каркасам адаптироваться к целительной среде. Например, трансплантат может ощущать присутствие тромбина (указывая образование сгустка) и высвобождать урокиназу для растворения сгустка, одновременно увеличивая доставку VEGF для ускорения восстановления эндотелия. Хотя такая изощренность все еще находится на лабораторной стадии, быстрый темп инноваций предполагает, что полностью функциональные, долговечные сосудистые каркасы с надежной эндотелиализацией станут клинической реальностью в течение следующего десятилетия.

В конечном счете, цель состоит в том, чтобы восстановить нормальную сосудистую функцию с помощью трансплантата, который не просто переносится организмом, но активно перестраивается в живой, самовосстанавливающийся канал. Достижение этой цели зависит от постоянного совершенствования стратегий эндотелиализации и творческой интеграции материаловедения, клеточной биологии и инженерных принципов.