Хроматография как инструмент для метаболомики и открытия биомаркеров

Разделение и обнаружение

Условия хроматографии оптимизированы по интересующим классам метаболитов. Например, колонка C18 с градиентом воды/ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты подходит большинству липидомиков. В колонках HILIC используются мобильные фазы с высоким органическим содержанием для полярных метаболитов. Температура колонки, скорость потока и объем инъекции корректируются для максимизации пиковой емкости и воспроизводимости.

Обработка данных

Данные хроматографии-масс-спектрометрии подвергаются пиковому обнаружению , выравниванию по образцам и нормализации (например, к общему количеству ионов или внутреннему стандарту). Инструменты, такие как XCMS, MZmine и Compound Discoverer, автоматизируют эти этапы. — анализ основных компонентов (] — частичный анализ с наименьшими квадратами-дискриминантом (PLS-DA) — идентифицирует метаболиты, которые различаются между группами. Аннотация использует базы данных, такие как HMDB, METLIN и NIST.

Подходы к метаболизму

Нецелевая метаболизм

Нецелевая метаболомика направлена на обнаружение как можно большего количества метаболитов без предварительного знания. Глобальное профилирование генерирует гипотезы о метаболических возмущениях.Хроматография должна быть широкой или множественными столбцами. Например, подход с двумя колонками (RP-LC и HILIC) охватывает как полярные, так и неполярные соединения.Нецеленаправленные данные являются полуколичественными и требуют тщательной проверки.

Целенаправленная метаболизм

Целевая метаболомика фокусируется на количественной оценке заранее определенного набора метаболитов, часто биомаркеров. Стабильные внутренние стандарты с изотопной маркировкой позволяют абсолютную количественную оценку. MRM на тройных квадрупольных инструментах обеспечивает высокую чувствительность и специфичность. Хроматография оптимизирована для целевых соединений, часто с более коротким временем выполнения для высокой пропускной способности.

Роль хроматографии в открытии биомаркеров

Фаза открытия

В открытии биомаркеров хроматография разделяет сложные биологические жидкости (плазма, моча, экстракты тканей) для выявления метаболитов, коррелирующих с болезнью. Например, аминокислоты с разветвленной цепью (BCAA) были идентифицированы как ранние маркеры резистентности к инсулину с использованием LC-MS. Нецелевые исследования сравнивают когорты, и сотни признаков кандидатов сводятся к нескольким десяткам посредством статистической фильтрации.

Фаза проверки

Перспективные биомаркеры должны быть проверены в более крупных независимых когортах. Хроматография обеспечивает воспроизводимость , необходимую для валидации. Стабильность времени удержания и точность массы обеспечивают последовательную идентификацию. Метод валидации включает оценку линейности, пределов обнаружения, точности и точности. Валидированный анализ необходим перед клиническим переводом.

Клинический перевод

Переход от исследований к клинической диагностике требует надежных, высокопроизводительных методов. Анализы на основе хроматографии для биомаркеров, таких как гомоцистеин (LC-MS/MS) и витамины D метаболиты (LC-MS) уже используются в клинических лабораториях. Автоматизация (например, онлайн SPE, связанный с LC-MS) снижает ручную обработку и увеличивает пропускную способность.

Тематические исследования биомаркеров заболеваний

Метаболомика рака

Раковые клетки демонстрируют измененный метаболизм — эффект Варбурга (аэробный гликолиз) (аэробный гликолиз). Хроматография позволила обнаружить повышенный лактат, измененные промежуточные соединения цикла TCA и изменения в нуклеотидном метаболизме. Например, 2-гидроксиглутарат является онкометаболитом в IDH-мутантных глиомах, обнаруженных GC-MS. Липидомики с использованием LC-MS выявили измененные фосфолипидные профили при раке молочной железы и предстательной железы.

Диабет и метаболический синдром

Метаболический синдром включает в себя дисрегуляцию липидов, аминокислот и глюкозы. Исследования хроматографии выявили BCAAs , ароматические аминокислоты (тирозин, фенилаланин) и ацилкарнитины как предикторы диабета 2 типа. Профилирование LC-MS церамидов и диацилглицеринов связывает липидный метаболизм с резистентностью к инсулину. Эти маркеры в настоящее время проверяются в крупномасштабных когортах.

Нейродегенеративные заболевания

Альцгеймер, Паркинсон и БАС включают метаболическую дисфункцию в мозге и периферии. Липидомики с использованием LC-MS выявили изменения в сфинголипидах и стеролах в спинномозговой жидкости. Уровни полиамина (спермидин, путресцин) изменяются при болезни Альцгеймера, обнаруживаются HILIC-MS. Хроматографические методы помогают идентифицировать сигнатуры метаболитов, которые коррелируют с когнитивным снижением.

Проблемы и решения

Эффекты матрицы и подавление ионов

Соответвляющие соединения могут подавлять ионизацию в MS. Лучшее хроматографическое разрешение снижает совместное элюирование. Использование изотопно-маркированных внутренних стандартов компенсирует матричные эффекты. Двумерная хроматография (LC×LC) или офлайновое фракционирование могут дополнительно очищать образцы.

Воспроизводимость данных

Межлабораторная изменчивость остается препятствием. Стандартизированные протоколы , образцы контроля качества и кросс-лабораторные исследования (например, с использованием NIST SRM 1950) улучшают воспроизводимость. Индексирование времени удержания с алкиламинов или другими калибрантами помогает выравнивать данные по прогонам.

Масштабные исследования

Метаболомика на уровне популяции требует обработки тысяч образцов. Автоматизированная подготовка образцов (робототехника) и U(H)PLC с короткими столбцами (например, 5-минутные градиенты) обеспечивают высокую пропускную способность. Алгоритмы коррекции матчей (например, коррекция на основе QC) адреса дрейфуют по длинным последовательностям.

Будущий прогноз

Разделение высокого разрешения

Достижения в колоночной технологии (например, суб-2 мкм частиц ядра-оболочки ) и ионной спектрометрии мобильности (IMS) добавляют размерность разделения на основе столкновения поперечного сечения. LC-IMS-MS могут разрешать изомеры и увеличивать пиковую емкость. Комплексная двумерная GC (GC×GC) набирает тягу для летучих метаболомик.

Автоматизация и миниатюризация

Микрофлюидные устройства и цифровые микрофлюидики разрабатываются для подготовки и разделения образцов на чипе. Автоматизированные онлайн системы SPE-LC-MS снижают ручные шаги, повышая воспроизводимость. Эти технологии сделают хроматографию более доступной для клинических лабораторий.

Интеграция с машинным обучением

Алгоритмы машинного обучения предсказывают время удержания, помогают в аннотации метаболитов из спектров MS / MS и идентифицируют закономерности в больших наборах данных.Объединение данных удержания хроматографии с масс-спектральной информацией повышает уверенность в идентификации биомаркеров. Модели глубокого обучения также могут предложить оптимальные условия разделения.

Заключение

Хроматография остается незаменимым инструментом для открытия метаболомики и биомаркеров. От разделения тысяч метаболитов до проверки клинических биомаркеров хроматографические методы обеспечивают необходимое разрешение, воспроизводимость и количественную точность. По мере развития приборов - с более высоким давлением, улучшенными колоночными химиями и интеграцией с ионной мобильностью и автоматизацией - хроматография будет продолжать стимулировать прогресс в точной медицине и метаболическом фенотипировании. Исследователи должны учитывать сильные стороны каждой техники (GC, LC, CE) и проектные рабочие процессы, которые максимизируют охват метаболома при сохранении качества данных.

Для дальнейшего чтения см. Страница темы «Nature Metabolomics» , Ресурс «Chromatography Online» и недавний обзор LC-MS в открытии биомаркеров . Кроме того, База данных о метаболизме человека (HMDB) предоставляет справочные спектры и информацию о путях, а Метаболомика Workbench предлагает общедоступные наборы данных и инструменты анализа.