Понимание электроспиннинга

Электроспиннинг является универсальным и высококонтролируемым методом изготовления волокон, который стал краеугольным камнем тканевой инженерии, особенно для создания каркасов, имитирующих нановолокнистую архитектуру нативной внеклеточной матрицы (ECM). В контексте ремонта хряща электроспун-каркасы предлагают перспективную платформу для поддержки функции хондроцитов, направляющего матричного осаждения и в конечном итоге восстановления функции суставов. Процесс в основном опирается на высоковольтное электрическое поле (обычно 10-30 кВ), применяемое между проводящим спиннеретом и коллектором. Когда электрическая сила преодолевает поверхностное натяжение полимерного раствора или расплава, заряженная струя выбрасывается, подвергается взбиванию неустойчивости из-за электростатического отталкивания и растягивается в непрерывные волокна с диаметрами от нанометров до нескольких микрометров. Растворитель испаряется во время полета (в электроспиннинге раствора) или расплав затвердевает (в электроспиннинге расплава), оставляя случайно ориентированные или выровн

В отличие от традиционных методов изготовления каркасов, таких как выщелачивание соли, газовое вспенивание или литье растворителей, которые производят поры в десятках до сотен микрометров, но не имеют непрерывной топографии волокон, электроспиннинг генерирует плотную сеть волокон, которые перекапитулируют физические сигналы, с которыми сталкиваются хондроциты in vivo. Хрящ сам по себе представляет собой плотную сосудистую ткань с высокоорганизованной ECM, в которой преобладают волокна коллагена II типа (диаметр 50-200 нм), переплетенные с протеогликановыми агрегатами. Электрошоковые каркасы могут аппроксимировать эту иерархическую структуру, обеспечивая как механическую поддержку, так и биологическое руководство для прикрепления клеток, пролиферации и дифференциации. Кроме того, высокое соотношение площади поверхности к объему нановолокон усиливает адсорбцию белков из культуральной среды или биологической среды, способствуя передаче сигналов клеток, опосредованных интегрином.

Помимо структурной мимикрии, электроспиннинг предлагает возможность включать биологически активные молекулы непосредственно в волокна, либо путем смешивания их с полимерным раствором, через коаксиальные спиннереты (волокна ядра-оболочки), либо через постспиннинговую функционализацию. Эта универсальность делает электроспиннинг привлекательной платформой для доставки факторов роста, цитокинов или лекарств контролируемым, устойчивым образом - особенно ценная особенность для регенерации хряща, где воспаление и дегенерация часто коморбидны. В оставшейся части этой статьи будут рассмотрены материалы, обычно используемые, основные методы электроспиннинга, соображения проектирования каркасов, текущие приложения и проблемы, которые остаются до клинического перевода становится рутиной.

Материалы, используемые в картильных имитирующих каркасах

Выбор полимера (полимеров) является, пожалуй, наиболее важным решением в электроспиннинге для конструирования хряща. Материалы должны быть биосовместимыми, биоразлагаемыми со скоростью, соответствующей образованию неотисс, обрабатываемыми с помощью электроспиннинга и способными поддерживать хондрогенные фенотипы. Были исследованы как природные, так и синтетические полимеры, часто в смесях для объединения желательных свойств. Ниже подробно обсуждается наиболее часто используемые материалы.

Синтетические полимеры

  • Поликапролактон (PCL): PCL представляет собой полукристаллический, биоразлагаемый полиэстер с медленной скоростью деградации (2-4 года in vivo), отличными механическими свойствами и одобрением FDA для многих медицинских устройств. Его низкая температура плавления (~60 °C) и растворимость в обычных органических растворителях (например, дихлорметан, хлороформ) облегчают электроспин. Однако PCL является гидрофобным и не имеет мотивов клеточной адгезии, поэтому он часто смешивается с природными полимерами или модифицированным поверхностью (например, обработка плазмы, коллагеновое покрытие) для улучшения прикрепления и распространения хондроцитов.
  • Поли(молочная-]ко-гликолевая кислота) (PLGA): PLGA является сополимером молочной и гликолевой кислот, скорость деградации которых может быть адаптирована соотношением мономеров. Волокна деградируют с помощью гидролиза, производя кислые побочные продукты, которые обычно хорошо переносятся. Было показано, что каркасы PLGA поддерживают пролиферацию хондроцитов и синтез ECM. Как и PCL, PLGA является гидрофобной и может потребовать смешивания с гидрофильными материалами или факторами роста для повышения биоактивности.
  • Поли(молочная кислота) (PLA) и поли(гликолевая кислота) (PGA): PLA (особенно L-изомер, PLLA) и PGA также были электроспунами для хрящевых применений. PLLA более кристалличен и деградирует медленно, в то время как PGA быстро деградирует. Их механические свойства (особенно жесткость) могут влиять на фенотип хондроцитов; очень жесткие субстраты могут способствовать образованию фиброкартила, а не гиалинового хряща. Поэтому смешивание с более мягкими компонентами или регулирование выравнивания волокон может улучшить результаты.

Природные полимеры

  • Желатин: Желатин получен из коллагена и сохраняет многие клеточно-связывающие мотивы (например, последовательности RGD). Он является водорастворимым, биоразлагаемым и относительно недорогим. Желатин может быть электроотвержден из водных растворов или сорастворительных систем, но его плохая механическая прочность и высокая растворимость в воде при физиологических температурах часто требуют сшивания (например, глютаральдегид, генипин, EDC/NHS) для поддержания структурной целостности. Было показано, что сшитые желатиновые нановолоконные каркасы поддерживают присоединение хондроцитов, пролиферацию и осаждение гликозаминогликана (GAG).
  • Коллаген типа I и II:] Коллаген является основным белком ECM в хряще (тип II) и является идеальным материалом каркаса из-за его естественной биоактивности, биосовместимости и слабой иммуногенности. Электроспиннинг чистого коллагена требует специализированных растворителей (например, 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропанола, HFIP) и тщательного контроля рН и ионной прочности. Сшивка также необходима для предотвращения быстрого растворения. Коллагеновые каркасы тесно имитируют нативный ECM и способствуют хондрогенезу, но их обработка является более сложной и дорогостоящей, чем синтетические полимеры.
  • Читозан:]Читозан представляет собой катионный полисахарид, полученный из хитина, со структурным сходством с ГАГ, обнаруженными в хрящевой ECM. Он биоразлагаем, нетоксичен и обладает антимикробными свойствами.Решения читосана электроспиннеобразуются из водных растворов уксусной кислоты, но его высокая вязкость и склонность к образованию полиэлектролитных комплексов могут затруднить прядение. Смешивание хитозана с PCL, желатином или поли(виниловым спиртом) улучшает перерабатываемость. Эшафот на основе читозана способствует пролиферации хондроцитов и поддерживает хондрогенный фенотип, отчасти благодаря положительному заряду, который облегчает связывание отрицательно заряженных ГАГ.
  • Hyaluronic acid (HA): HA is a non-sulfated GAG abundant in cartilage and synovial fluid, playing key roles in joint lubrication and cell signaling. HA is highly hydrophilic and anionic, making it challenging to electrospin as a pure polymer; it is usuallyСмешанные с несущими полимерами (например, PCL, желатин) или химически модифицированные (например, метакрилирование) для обеспечения сшивания и образования волокон. HA-содержащие каркасы усиливают миграцию хондроцитов и осаждение ECM, но требуют тщательной обработки, чтобы избежать быстрого растворения.

Смеси синтетических и природных полимеров все чаще используются для сочетания механической прочности синтетических и биологических сигналов природных веществ. Общие комбинации включают PCL/гелатин, PLGA/коллаген и PCL/читозан. Такие смеси могут достигать диаметров волокон в диапазоне 200-1000 нм, пористости > 80% и модуля растяжения, сопоставимого с нативным хрящом (0,5-2 МПа).

Электроспиннинговые технологии

Базовая установка электроспиннинга была усовершенствована в нескольких вариантах, каждый из которых предлагает уникальные преимущества для проектирования хрящевых лесов.

Решение Electrospinning

Это наиболее широко используемый метод. Полимер растворяется в летучем органическом растворителе (или системе на водной основе для природных полимеров) для формирования раствора с оптимальной вязкостью, проводимостью и поверхностным натяжением. Такие параметры, как расход (0,5-5 мл/ч), приложенное напряжение (10-25 кВ), расстояние от иглы до коллектора (10-20 см) и окружающие условия (температура, влажность) должны быть оптимизированы для каждой системы полимера-растворителя. Однако электроспиннинг раствора может производить непрерывные волокна с диаметрами, такими как десятки нанометров. Однако использование органических растворителей (например, HFIP, хлороформ, DMF) вызывает опасения по поводу остаточной токсичности, требуя тщательной вакуумной сушки или после обработки для удаления следовых растворителей до посева ячеек. Кроме того, летучее растворительное испарение может создать пористую морфологию поверхности, которая дополнительно увеличивает площадь поверхности - преимущество для адгезии ячеек, но потенциальный источник механической слабости, если поры становятся

Расплавление Electrospinning

Расплав электроспиннинга использует полимер расплава вместо раствора, устраняя необходимость в органических растворителей и избегая проблем токсичности. Этот метод особенно привлекателен для полимеров, как PCL и PLA, которые имеют четко определенные точки плавления. Расплав электроспиннинга, как правило, производит большие диаметры волокон (обычно > 1 мкм) по сравнению с раствор электроспиннинга, потому что вязкость расплава выше и струя не подвергается той же степени нестабильности взбивания. Тем не менее, расплав электроспиннинг предлагает преимущества для увеличения производства (не требуется восстановление растворителя) и для создания более толстых, более механически прочных каркасов. Последние достижения в расплаве электроспиннинг записи (MEW) позволяют непосредственное запись волокон в контролируемом рисунке, что позволяет изготовление упорядоченных каркасов с определенной геометрией пор - особенность, которая очень желательна для хрящевой ткани инженерия для облегчения диффузии питательных веществ и инфильтрации клеток.

Коаксиальный электроспиннинг

Коаксиальный электроспиннинг использует концентрическую установку с двумя иглами: внутренняя игла несет основной раствор (часто содержащий факторы роста, лекарства или механически поддерживающий полимер), в то время как внешняя игла несет оболочку полимерного раствора. Высокое напряжение вызывает одновременное выброс обоих растворов, образуя сердечник-оболочку, которая инкапсулирует основной материал. В картилевой инженерии коаксиальный электроспиннинг используется для инкапсуляции трансформирующего фактора роста -β1 (TGF-β1) или инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) в оболочку PCL или PLGA, что позволяет устойчивое высвобождение в течение нескольких дней или недель. Этот метод уменьшает начальный выброс разрыва по сравнению с простым смешиванием и защищает биологически активные молекулы от денатурации во время электроспиннинга. Волокна ядра-оболочки также могут быть разработаны для механической жесткости ядра (например, PCL) и более мягкой, биоактивной оболочки (например, желатин или коллаген), имитируя композитную структуру нативного ECM.

Многоструйный и бесшовный электрошпиннинг

Традиционный одноигольной электроспиннинг имеет низкую пропускную способность (≈0,1-1 мл/ч), ограничивая его использование для крупномасштабного изготовления каркасов. Многоструйные системы с использованием нескольких игл или вращающегося барабана с несколькими спиннеретами могут увеличить скорость производства. Бесшкольный электроспиннинг, в котором электрод (например, вращающийся провод или цилиндр) поднимает полимерный раствор из ванны и инициирует несколько струй одновременно, может достигать пропускной способности на порядок выше. Хотя эти методы производят менее однородные диаметры волокна, чем одноигольное прядение, они исследуются для коммерческого масштабного производства хрящевых каркасов. Для ремонта хряща, где дефекты часто малы (1-5 см2) и специфичны для пациента, пропускная способность может быть не ограничивающим фактором, но для будущих готовых продуктов, масштабируемость станет необходимой.

Выровненные коллекционеры волокон

Ориентация электроспуновых волокон существенно влияет на поведение клеток. Случайные волокна производят изотропные механические свойства и способствуют распространению клеток во всех направлениях, тогда как выровненные волокна индуцируют контактное наведение и анизотропные механические свойства — важные для имитации зональной организации суставного хряща, где коллагеновые волокна в поверхностной зоне ориентированы параллельно суставной поверхности, в средней зоне случайны, а в глубокой зоне перпендикулярны подхондральной кости. Для получения выровненных волокон коллекторы могут быть спроектированы как быстро вращающиеся барабаны (до нескольких тысяч об/мин), параллельные электродные массивы или вращающиеся диски. Хондроциты, культивируемые на выровненных волокнах, показывают повышенную экспрессию коллагена II и аггрекана по сравнению с таковыми на случайных волокнах, и полученный каркас может выдерживать более высокие растягивающие нагрузки вдоль направления волокна. Для полноразмерных дефектов хряща исследуются многослойные каркасы с различными ориентациями волокон в каждой зоне для воспроизведен

Проектирование картильных имитирующих каркасов

Проектирование электроотверждаемого каркаса для хряща требует баланса структурных, механических и биологических свойств. Эскафот должен поддерживать клеточное распространение, поддерживать круглую морфологию (типичную для хондроцитов), способствовать осаждению ECM и противостоять механическим нагрузкам от совместного движения. Ключевые параметры конструкции включают диаметр волокна, выравнивание, пористость, размер пор, скорость деградации и химию поверхности.

Механические свойства

Суставной хрящ представляет собой вязкоупругий материал с модулями сжатия 0,5-2 МПа и модуля растяжения 5-15 МПа. Электрошоковые каркасы обычно имеют более низкий модуль сжатия (0,05-0,5 МПа) из-за их высокой пористости и малого диаметра волокна, но они могут быть усилены за счет увеличения диаметра волокна, уменьшения пористости или смешивания с более жесткими полимерами (например, добавление нанокристаллической целлюлозы или гидроксиапатита). Для хряща идеальный каркас должен быть достаточно жестким, чтобы выдерживать совместную нагрузку, но не настолько жестким, чтобы он предотвращал опосредованное клетками ремоделирование матрицы. Было показано, что динамическая нагрузка на матрицу в биореакторах повышает хондрогенные маркеры, поэтому механические свойства каркаса также влияют на то, как клетки реагируют на механические сигналы.

Пористость и размер пор

Высокая пористость (>80%) необходима для диффузии питательных веществ и удаления отходов в сосудистой ткани, такой как хрящ. Однако электрошоковые каркасы часто имеют небольшие поры (несколько микрометров) из-за плотной упаковки волокон, которые могут препятствовать инфильтрации клеток. Разработаны различные стратегии для увеличения размера пор: включение жертвенных волокон (например, водорастворимого ПЭО, который можно выщелачивать), криогенного электроспиннинга (сбор волокон на холодной нижнечелюсти для образования кристаллов льда, которые создают макропоры) или объединение электроспиннинга с выщелачиванием частиц. Размеры пор в диапазоне 100-300 мкм считаются оптимальными для хондроцитного всхода. Эффективность посева клеток может быть улучшена с помощью динамических методов посева (например, центрифугирование или орбитальный шейкер) или путем создания макропористых архитектур с использованием 3D-печати в сочетании с электроспиннингом.

Уровень деградации

Эшафот должен деградировать со скоростью, соответствующей новому осаждению ECM - обычно в течение нескольких месяцев для восстановления хряща. Быстроразлагающиеся полимеры, такие как PGA (недели до месяцев), могут потерять механическую целостность до того, как будет получена достаточная матрица. Медленно разлагающиеся полимеры, такие как PCL (годы), могут сохраняться слишком долго, препятствуя полной интеграции. Смеси и сополимеры (например, PLGA с индивидуальным соотношением мономеров) позволяют точно настраивать кинетику деградации. Ферменторазлагаемые сшивки (например, чувствительные к матрице металлопротеиназы пептиды) также могут быть включены, чтобы сделать деградирующие клетки чувствительными.

Функционализация поверхности

Для повышения биоактивности электроспуновые волокна могут быть покрыты белками ECM (коллаген, фибронектин, ламинин) или нагружены факторами роста. Было показано, что иммобилизация TGF-β1 или костного морфогенетического белка-2 (BMP-2) на поверхности волокна усиливает хондрогенез мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Кроме того, включение адгезивных пептидов (RGD, YIGSR) может способствовать присоединению хондроцитов без рисков, связанных с белками животного происхождения.

Приложения и текущие исследования

Электроспун нановолоконные каркасы были исследованы для in vitro систем хрящевой модели, in vivo ремонт остеохондральных дефектов на животных моделях и ранних клинических испытаний. В in vitro исследованиях хондроциты человека были засеяны на электроспун PCL/гелатиновых каркасах и поддерживали хондрогенный фенотип в течение 28 дней с увеличением содержания ГАГ и коллагена типа II. Было показано, что коаксиальные волокна, высвобождающие TGF-β1, индуцируют дифференцировку МСК человека в хондроцитоподобные клетки без необходимости добавления внешнего фактора роста.

В естественных условиях исследования на моделях кроликов, коз и овец показали многообещающие результаты. Например, электроспун PCL/читосановые каркасы, имплантированные в остеохондральные дефекты коленного сустава кролика, способствовали восстановлению фиброхондрий с лучшей интеграцией, чем необработанные элементы управления. В модели коз, двухслойные каркасы, сочетающие электроспуновый слой PLGA (сбоку хряща) с заменителем микропористых костных трансплантатов (сбоку кости) достигли почти полного заживления через 6 месяцев. Несколько пилотных исследований на людях использовали электроспун коллаген или PLGA каркасы для восстановления хряща в сочетании с аутологичными хондроцитами или МСК, с улучшением показателей боли и функции. Однако долгосрочное наблюдение и рандомизированные контролируемые испытания по-прежнему отсутствуют.

Помимо ремонта на основе каркаса, электроспуновые волокна используются в доставке лекарств для контроля воспаления (например, включающих противовоспалительные препараты, такие как диклофенак) и в качестве барьерных мембран, направляемых регенерацией ткани или для смазки суставов (маты электроспун гиалуроновой кислоты).

Проблемы и будущие направления

Несмотря на огромный прогресс, остается несколько проблем, прежде чем электроспун хрящевые каркасы станут стандартным клиническим вариантом.

Инфильтрация клеток

Ограниченный размер пор электрошоковых матов — часто ниже 20 мкм — ограничивает миграцию клеток в интерьер каркаса, что приводит к ободку клеток на поверхности и некротическому ядру. В то время как такие методы, как выщелачивание соли, криогенное прядение и гибридная 3D-печать / электрошпиннинг, улучшили инфильтрацию, достижение равномерного распределения клеток по толстым каркасам (> 2 мм) остается трудным. Будущая работа может сосредоточиться на динамических системах культуры (биореакторах перфузии) для улучшения переноса питательных веществ и на создании каркасов с градуированной пористостью, которая направляет клеточную колонизацию.

Вазкулирование и анизотропия

Хрящ является аваскулярным, поэтому каркасы не требуют вспенения кровеносных сосудов. Однако для дефектов остеохондра (с участием хряща и кости) субхондральная часть кости должна подвергаться васкуляризации. Электрошпиндральные каркасы для двухслойных или градиентных конструкций должны быть спроектированы с размерами пор и факторами роста (например, VEGF для костной стороны), которые поддерживают как хондрогенез, так и остеогенез. Кроме того, имитирование зональной структуры хряща (поверхностная, средняя, глубокая зоны) с различными ориентациями волокон и биохимическими композициями является текущим исследовательским фокусом: некоторые группы используют электрошпиннинг для производства слоистых матов или шаблонов 3D-печати, которые направляют осаждение волокон.

Масштабирование и стерилизация

Переход от лабораторного масштаба к промышленному производству при сохранении качества и воспроизводимости является серьезной инженерной задачей. Электроспиннинг чувствителен к условиям окружающей среды (влажность, температура), изменчивость полимерных партий и засорение игл. Ненужные и многоструйные системы совершенствуются, но проблемы однородности сохраняются. Методы стерилизации (оксид этилена, гамма-облучение, электронный луч) не должны разрушать каркас или остаточные растворители; сверхкритическая стерилизация CO2 появляется в качестве мягкой альтернативы. Регуляторное утверждение требует демонстрации биосовместимости, механической консистенции и воспроизводимости в много-много раз.

Долгосрочная стабильность и интеграция

После имплантации каркас должен со временем разрушаться, пока новая ткань заменяет его. Однако побочные продукты деградации (например, молочная кислота из PLGA) могут снижать местный рН, потенциально вызывая воспаление или кальцификацию. Контроль деградации посредством проектирования полимеров и использование основных солей для буферной кислотности являются исследуемыми стратегиями. Интеграция с хрящом-хозяином - общеизвестно трудная проблема - усиливается путем формирования бесшовного интерфейса через сшивку in situ или биоадгезивные покрытия.

Будущие направления

Передовые электроспиннинговые технологии, такие как электроспиннинг ближнего поля (NFES), позволяют напрямую записывать волокна с точностью микрометра, позволяя формировать формы каркасов, специфичные для пациента, которые соответствуют геометрии хрящевого дефекта (полученные из МРТ или КТ). Гибридные системы, сочетающие электроспиннинг с 3D-биопечатью, могут создавать каркасы как с микро-, так и с макромасштабной иерархией: 3D-печатная рама обеспечивает структурную целостность и большие поры, в то время как электроспанные нановолокна заполняют интерстики для обеспечения клеточной обучающей топографии. Умные каркасы, включающие проводящие полимеры (например, полианилин) для электрической стимуляции - которые способствуют хондрогенной дифференциации - и биоразлагаемая электроника для мониторинга созревания тканей в режиме реального времени - это будущие возможности. Клинические испытания с электроспанными хрящевыми каркасами, как ожидается, расширятся в течение следующих пяти лет, особенно для небольших ф

Для дальнейшего чтения, проконсультируйтесь с недавними обзорами по электроспиннингу для хрящевой тканевой инженерии (]PubMed ссылка ), коаксиальный электроспиннинг для доставки фактора роста (]Биомедицинские материалы ), и роль выравнивания волокон в хондрогенезе (]Acta Biomaterialia .