Akış cytometri modern hücre biyolojisinde temel bir teknolojidir, araştırmacıların akışkanları ve kimyasal özelliklerini ikinci başına binlerce bireysel hücre özelliklerini hızla analiz etmelerine olanak sağlar. Bu teknik, hücre heterojenliği, fonksiyonel durumları ve dinamikleri anlamak için vazgeçilmezdir. Araştırma giderek daha karmaşık bir multi-parametre immünofajına odaklanırken, akansiyonelleri birleştirerek, optikleri ve elektronikleri, biyolojik olarak, biyolojik gelişimimizi ve biyolojik çeşitliliğimizi derinleştirir.
Akış Cytometri nedir?
Anada, cytometri, lazerin askıya alınmasına neden oluyor, hafif ve floreseli olarak etiketlenen antikorlar veya boyalar üretiyorsa, hücre büyüklüğüne bağlı olarak, yanlı (SSC) iç karmaşıklıkları gösterir.Innöral sinyalleri, ışık ve floresans sinyalleri, fluorsanly etiketli antikorları veya boyaları üretir.
Hidrodinamik Odaklı ve Akış Hücresi
Herhangi bir akış cytometresinin kalbi akış hücresidir, örnek akışı çevreleyen bir yığın sıvı kullanarak hızlandırır.Enminar akış profili güçleri, akış merkezine hücrelere, tutarlı aydınlatma lazer sağlamak. Proper Hidrodinamik en azaları en aza indirir ve tek olaylar olarak saymalarını engeller. Modern araçlar genellikle cuvetli veya jet tabanlı tasarımları kullanır, her biri rakipli aydınlatma kapasitesi ile.
Işık Scattering: FSC ve SSC
Bir lazer ışını bir hücreye çarptığında, tüm yönlerde ışık saçları. İleri saçlar (küçük açılardan ayrılır, tipik olarak 1-10 derece) hücre çapındaki ve iyi bir ilk hücre boyutunun ölçülmesidir. Yansı (90 derecede parçalanır) iç yapıları yansıtabilir: neutrophils gibi birçok granüller, yüksek SSC; lenfositler yüksek SSC’ye sahiptir. Bu iki tek parametre genellikle kan örneklerinde büyük leukositik popülasyonları ayırt edebilir.
Fluorescence Tespit ve Multi-parametre Analizi
Daha spesifik analiz için, hücreler floraforlarla lekelenir - doğrudan konjugated antikorlar, fluorescent boyalar (e.g., DNA içeriği için), veya canlı-telektüel aynalar için (örneğin, her bir fluorofore, ayrı PMTs ile ayrı bir şekilde yayılan ışıklara sahiptir.Burçlar 30 ila 405 nm, 488 nm, nm, nm) ve bir dizi, dichroic aynalar ve bant filtreleri, farklı PMTs ile aynı anda ortaya çıkan bir şekilde sabitlenir.
Anahtarlama bileşenleri
Bir akış cytometresinin önemli bileşenlerini anlamak, araştırmacıların ayarları optimize etmelerine ve sorunları çözmelerine yardımcı olur.
- [FONT:0]Fluidics System:[Dönetici:[Dönetici:0)[Dönetici:0))) Teslimler örnek ve kontrollü baskı altında sıvı.
- [FONTS:0)Optics:[Dönetici: [Dönder:) Lazerler (solid-state, gaz veya diyot), lens, aynalar ve filtreler. Lazer gücü ve hizalama hassaslığı ve sinyal-to-noise oranı.
- [FONT:0)Electronics:[Dönetici:[Dönetici] PMTs, fotonları elektrik sinyallerine dönüştürür. Signal processing, amplifikasyon (linear veya logaritmik), çiftleştirme ve pul işleme içerir.
- [FONT=0]Data Acquisition and Analysis Software:[DDiva, Beckman Coulter Kaluza, veya FlowJo gibi açık kaynaklı alternatifler) kontrol cihazı, rekor olay verileri ve görselleştirmeyi etkinleştirin.
Fluorokromlar ve Panel Tasarımı: Pitfalls'tan Kaçınmak
Çok renkli bir panel için doğru floraları seçmek çok önemlidir. İdeal floraforlar parlak emisyonlar, minimum ⁇ çakışma ve mevcut lazer hatlarıyla uyumluluk, her bir fluorofor ve dikkatli el veya otomatik ayarlama için yapılan emisyon spektrumları gerektiğinde gerçekleşir.Bu doğru şekilde düzeltilmesi yanlış pozitif popülasyonlara yol açabilir.
Başka bir husus ise, FMO'ların en büyük kurucularını ortaya çıkarır; düşük otofloresliliği ayırt ederken temeldir.In cell kültürü çalışması, otofloresans (e.g.)
Hücre Kültürü Analizi Uygulamaları
Akış cytometri, kültürdeki hücrelerin karakterlendirilmesi için çok yönlü bir araçta bulunmaktadır. Aşağıda, belirli örnek hazırlık ve kontrol stratejileri gerektiren her bir uygulama vardır.
Hücre Viability Değerlendirme
Canlı, apoptotik ve ölü hücrelerin kesilebilir boyaları, propidium iodide (PI) veya 7aminoactinmisin D (7-AAD), sabit olmayan membranlar tarafından dışlanır ve böylece sadece FSC vs. SSC'de daha sofistike boyalar (örneğin, daha yüksek bir membran ile daha yüksek ışık ve daha düşük ışık ile) ile daha yüksek bir membran ile canlı renkte görünür.
Hücre Lisans Analizi
DNA içeriği fluorescent boyaları (propidium iodide, DAPI, Hoechst 33342) G0/G1, S ve G2/M aşamalarının etkilerini incelemek için kullanılır. DNA içeriği iki zirve gösterir: G0/G1 zirvede (2n DNA) ve G2/M zirve (4n DNA) ve kültürdeki hücreler arasında orta sınıf S-fayda hücreler arasında, bu analiz, uyuşturucuların etkilerini incelemek için kullanılır.
Apoptosis Tespit
Akış cytometrisi birpoptozun birden çok adımını atabilir. Klasik assay, PIin V + / PI-IC, FTC'nin iki pozitif olduğunu tespit etmek için ekin V + / MATLAB'in otomatik olarak test edilmesi gerekir.
Hücre Proliferasyon Takip
Zaman boyunca hücrelerin bölünmesi, araba kutuları gibi boyalarla yapılabilir. Her bölüm döngüsü, birkaç gün sonra, birden fazla zirvenin indeks ve bölünme sayısına izin verir.Bu yöntem T-celleler ve kök hücre çalışmaları için yaygın olarak kullanılır.
Immunophenotyping
Kültürde bağışıklık hücreleri, yüzey işaretleyicileri (örneğin, CD4 vs. CD8 T hücrelerde CD19, B hücreleri) rutindir. Paneller genellikle aktivasyon, hafıza veya düzenleyici devletler tanımlamak için 5-15 işaret içerir. Ekstracellular lekeleme, uygun hücreler üzerinde yapılırsa; eğer intracellular ktokineler veya transkripsiyon faktörleri ölçülmelidir (örneğin, IFN- ⁇ , FoxP3), düzeltme ve permeabilitesi gereklidir.
Hücre Sorting (FACS)
Fluorescence-aktif hücre sıralaması (FACS) uygun heath sıvısı altında yapılan hücrelere göre analiz eder. Common applications arasında nadir hücreler (örneğin, transdüktörler) altmış kültür veya moleküler analiz için ayrılır. Sorting protects cell viability if performed under steril koşullar altında yapılırsa.
Akış Cytometri için Hücreleri Hazırlayın: En İyi Uygulamalar
Uygun örnek hazırlık olmadan, en iyi enstrüman bile güvenilir veriler üretemez. Anahtar adımlar şunlardır:
- [FONT:0) Tek hücre süspansiyonu:[Dönetici:[Dönetici:)) Clumps, μm veya 70 μm sustumadan önce iki katına çıkarılması gereken olayları iki katına çıkarmalı.
- [FONT:0)Blocking:[[Dönetici: 0) Proubate hücreleri serum (aynı tür ikincil antikorlar) veya özel olmayan bağlayıcıları azaltmak için temizlenmiş Fc reseptör antikorları.
- [FONT:0)Antibody titrasyon:[Dönetici:[Dönetici:0)En yüksek sinyal-to-noise oranı (en azından olumlu ve negatif popülasyonlar arasında maksimum ayrımı elde etmek için en iyi konsantrasyonu belirlemek için seri dillemler kullanın.
- [FONT:0)Sing:[Dönetici: [Dönetici: 0,4 °C'de 20–40 dakika boyunca karanlıkta (veya üretici tarafından tavsiye edilen) uygun bir tamponla yıkama adımları içerir (PBS +% 0 BSA + 2 mM EDTA).
- [FONT:0)Denetler: [Dönetici:[Dönetici:0)) Önli kontroller, tek kullanımlık kontroller ve kapı sınırlarını tanımlamak için FMO kontrolleri daha az güvenilirdir, ancak birincil anti-faşın özel bağlayıcısını değerlendirmek için kullanılabilir.
- [[Düzücü:0)Fixasyon:[Dönetici:[Dönetici:0) Eğer hücreler hemen çalıştırılamazsa, 4°C'de 1-4 paraformdehit ve mağaza ile tamir edilebilir.
Analiz Data ve Yorumlama Sonuçlar
Veri analizi, arsalama ve arınma sürecidir. Tipik iş akışları şunları içerir:
1. Canlı Hücre Kapısı Oluşturma
Plot FSC-Area (FSC-A) vs. SSC-Area (SSC-A) Canlı hücreler genellikle küçük, düşük hacimli olaylar olarak görünür; ölü hücreler genellikle ölü hücreleri dışlamak için viability boya kapısı dahil.
2. Çifte Disiplin
FSC-A (area) vs. FSC-H (height) tek hücreler için düşmektedir; çiftler yüksek alana sahip yüksekliğe sahiptir. Alternatif olarak, FSC vs. FSC-W ( genişlet) Bu adım DNA içeriğini veya sıralamayı analiz ederken zorunludur.
3. Fluorophore-Specific Gates
Rehin edilen verileri kullanarak, her bir fluorofore kanalı negatif bir kontrole karşı (örneğin, FMO) veya biyolojik referans popülasyonlarını (örneğin, CD) tanımlamak için (örneğin, HLA-DR için T hücreleri).
4. İstatistiksel Raporlama
Her kapıdaki hücrelerin yüzdesi (standart sapma ile çoğaltmalar arasında yönetildi) ve uygun olduğunda, medyan flores yoğunluğu (MFI) veya geometrik anlamına gelir. Hücre döngüsü için, çoğalma için modelleme yazılımı kullanın.
Ortak Sorun Giderme Sorunları
| Issue | Possible Cause | Solution |
|---|---|---|
| Low event rate or clogging | Cell aggregates or debris | Filter sample; add adequate EDTA; reduce cell concentration |
| High background fluorescence | Dead cells autofluoresce; antibody aggregates; insufficient blocking | Use live/dead gates; spin antibodies to remove aggregates; increase Fc block |
| Unstable baseline or drift | Temperature changes; air in fluidics; laser instability | Warm up instrument; prime fluidics; monitor laser power |
| Unexpected shifts in compensation | PMT voltage changed; different lot of antibody | Titrate new antibody; re-compensate each day; use consistent PMTs |
Sınırlar ve Tahminler
Akış cytometri güçlü olsa da, askıya almada tek hücreler üzerinde toplanmıştır; uzaysal bağlam (önemli mimari) kaybedilir. Teknik yarıktitatiftir; MFI'deki göreceli farklılıklar sağlam olsa da, mutlak molekül numaraları kalibreli ölüm gösterebilir.
Future Path in Flow Cytometry for Cell Culture
Alan hızla gelişmektedir.ETHFLT:0)Spectral aktı cytometri[DKD)[Üye Olmayan Her Bir FİLM) tüm emisyon spektrumlarını, gruplar ve zaman aralığına izin vermek yerine, tek bir panelde daha fazla parametrenin kullanılmasını sağlar.Dönetici:2).Mas cytometry (CyTOF)[Dönetici)[Dönetici)[Döneticileri kullanarak yüksek çözünürlükte yüksek çözünürlükte bulunan mikro ekran görüntülerin yüksek çözünürlükte kullanılması.
Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç
Akış cytometri, hücre popülasyonlarını kültürde analiz etmek için temel bir araç olarak kalır. Temel viability checks to sofistike multi-parametre immünphenotyping and cell sorting, it provides nicel, tek hücreli çözüm verileri, diğer yollarla elde etmek zor olacaktır. Başarılı uygulama, sadece temel hesaplama ve fore problemlerini anlamak için değil, aynı zamanda titiz örnekleme, uygun kontroller ve dikkatli veri yorumları sunar.