CRISPR-Based Hücre Mühendisliğine Giriş

Kombinasyonlar düzenli olarak uzaysal kısa bir palindromal tekrarlar (CRISPR) teknolojisi, araştırmacıların kültürleşmiş hücrelerin genomunu nasıl manipüle ettiğini temel olarak değiştirdi.Kesinlikle, nüklepler veya TALENler, CRISPR sistemleri, bilim insanlarının hücre hatları oluşturmalarına, fonksiyonel genomik ekranları gerçekleştirmesine ve bugün daha ayrıntılı bir şekilde hastalık modellerini yapmalarına izin veriyor.

Bu makale, CRISPR'ı kültür hücreleri değiştirmek için kapsamlı bir teknik bakış sağlar. CRISPR-Cas9'un temel bileşenleri, teslimat ve seçim, gelişmiş düzenleme stratejileri, ortak tuzaklar ve sahayı ileriye götüren yeniliklere ilişkin ayrıntılı bir kılavuzluk veriyoruz.

CRISPR-Cas9'un temel bileşenleri

CRISPR-Cas9 iki temel molekülden oluşur: Cas9 endonüaz ve tek bir rehber RNA (sgRNA) glokomutan DNA bölgesine tamamlayıcı olan 20 taneciklik alanı içerir, ancak squalegen (D) Cas9'u kesmek için bir scaffojenler tarafından takip edilir, hedef DNA'yı bir kez daha kısa bir protoprotein (PAM) bir kez PAM tabakası (PAM) bir kez daha takip etmelidir.

Araştırmacılar, iki uçlu yol kenarındaki araçları kullanarak sgRNA'ları tasarlayabilirler: 0,0) OKT OKT[Dönderlik faaliyetinin en üst düzeye indirilmesi ve hedef dışı potansiyelin en aza indirilmesi için, DSB daha sonra iki endojen yol kenarından biri tarafından tamir edilir: Doğru düzenleme veya muhabirlik katlamaları anlamak için doğru yol yolları belirlemek için doğru bir yol.

NHEJ: Knockouts and Indel Mutations

Çoğu kayıp işlevli çalışma için, NHEJ tercih edilen yoldur. Cas9 ve bir kodlama exon'u hedefleyerek, araştırmacılar çerçeve değiştirme veya erken durdurma kodonlara neden olan bir karışım yaratırlar. Bir kurtarma dönemi sonra, hücreler tek hücre klonlanır ve sıralanır.Bu yaklaşım, gen temelliği incelemek için hücre hatlarında tümeles yaratmak için yaygın olarak kullanılır.

HDR: Knockins ve Precise Modifications

Kesin bir değişiklik gerekli olduğunda - bir fluorescent etiketi eklemek gibi, bir nokta mutasyonu veya bir koşullu allele - HDR'nin çalıştırıldığı dörtlü hücre hattında HDR verimliliği genellikle düşük (1-10%) ve bir bağışçı şablonu zenginleştirmek için.

CRISPR bileşenleri Kültür Hücrelerine Teslim Edilmesi

Bir CRISPR deneyinin başarısı, Cas9 proteininin ve sgRNA'nın nükleğe yoğun olarak teslim edilmesine bağlıdır. Çeşitli yöntemler mevcuttur, her biri avantaj ve sınırlamalarla ilgilidir.

Lipofection

Lipofection, HEK293T gibi kedionik lipid reaktiflerini kullanarak karmaşıkları, birincil hücreler için daha az verimlidir, kök hücreler ve süspansiyon hücreleri için de makul bir bağışıklık yanıtına neden olabilir.

Elektroporasyon

Elektroporasyon, hücre membranını geçici olarak istikrarsızlaştırmaya, DNA, RNA veya RNP komplekslerine giriş yapmak için kısa bir elektrik nabzı uygular - Lonza Nucleofector veya Thermo Fisher Neon özellikle de zor-transfect hücreleri, indüklenen pluripotent kök hücreleri (iPS48C) ve T hücreleri. RNP kompleksinin elektroporasyonu - önceden bilgilendirilen Cas9 proteini sgRNA'ya bağlı olarak - özellikle popülerdir çünkü özellikle de popülerdir.

Viral Vectors

Transfeksiyon için rerakter olan hücreler için, viral transdüksiyon güvenilir bir alternatif sağlar. Lentiviral vektörler Cas9 ve sgRNA ekspres nedenleri entegre edebilir, onları havuzlu CRISPR ekranları için ideal hale getirir. Adeno-associated virüsü (AAV) vektörleri de HDR deneylerinde bağışçı şablonların teslim edilmesi için kullanılır, ancak paketleme kapasitesi sınırlı (~4.5 kb).

Mikroinjeksiyon ve Nanopartikül-Based Yöntem

Mikroinjeksiyon iş yoğundur, ancak transgenik hayvan üretimindeki zygote düzenleme için sıklıkla tek hücreli hassaslığa ulaşabilir.Daha yakın zamanda, lip nanopartiküller ve altın nanopartiküller Cas9 m ve sgRNA'nın geçici teslim edilmesi için geliştirildi, daha düşük immünitelik ile daha düşük bir alternatif sunuyor.

Seçme, Zenginleştirme ve Edited Hücrelerin Geçerliliği

Teslimattan sonra, sadece bir alt hücre istenen düzenleme taşıyacaktır. Zenginleştirme stratejileri, alt uç deneyler için saf bir nüfus elde etmek için gereklidir.

Fluorescent Reporters ve FACS

Bir fluorsan muhabiri (örneğin, GFP veya BFP) düzenlemede veya eş-delivery kullanarak, FACS'nin başarıyla değiştirilebilmesine izin verir.For HDR knockins, hücreler floresan etiketinin ifadesine dayanarak sıralanabilir, büyük ölçüde dağınık izolasyonu hızlandırabilir.

Seçim Antibiyotikleri

Bir purkomisin, blasticidin veya nemisin direnci genini tanıtılırsa, antibiyotik seçimi, düzenlenmiş hücreler için hızla zenginleştirebilir. Ancak bu yöntem, hedefteki direniş gensini rastgele entegrasyon olaylarına karşı entegre eden hücreler arasında ayrım yapmaz.

Genotyping ve Validation

Candidate klonlar PCR, Sanger sequencing veya sonraki nesil sequencing kullanarak genotip olmalıdır.For knockout klons, the cut site and Western blotting for protein kayıplar için.For knockins, long-range PCR hem homoloji kolları doğru entegrasyon ve sequencing onarımlar için onarımlar için eklenebilir.

Araştırmada CRISPR-Modified Hücrelerin Uygulamaları

CRISPR-edited hücreleri kullanılarak ele alınabilecek deneysel sorular geniştir. Aşağıda birkaç önemli alanı vurgulıyoruz.

Fonksiyonel Genom Ekranları

Havuzlu CRISPR ekranları, işlem için gerekli olan binlerce sgRNA'yı içeren lentiviral kütüphaneleri kullanıyor.Bu yaklaşım, yeni kanser açıklarını keşfetmede enstrümantal hale geldi ve bağışıklık yanıtlarının düzenleyicileri için ev sahibi faktörler oldu.

Hastalık Isogen Hücre Hatları ile Modelleme

Hastaya özgü mutasyonları kontrol hücresi çizgisine tanıtarak, araştırmacılar MCPE mutasyonunu yalnızca bu tek değişikliklerin DNA onarımını ve tümörigenezini nasıl etkilediği konusunda kesin bir çalışma sağlar.Örneğin, hastalardan iPSCs, tedavi etmek için güçlü bir platform sağlayarak HDR'yi kullanarak düzeltilebilir.

CRISPR Interference and Aktiv (CRISPRi/a)

Catalytically ölü Cas9 (dCas9) transkriptle represörler (örneğin, KRAB) veya aktive ediciler (örneğin, VP64) DNA'yı kesmek olmadan gen ifadesini modülasyon sağlar. CRISPRa yüksek spesifikite ile genleri susturabilir, ancak CRISPRa can upregulate endojen genler.

Lineage Tracing ve Barcoding

Bir kütüphaneyi güvenli bir liman locusuna doğru tek barkod dizilerini sağlayarak, araştırmacılar hücre popülasyonlarının zamanlaki pıhtı dinamiklerini takip edebilir.Bu teknik, CRISPR barkoding veya CARLIN olarak bilinen, bireysel hücrelerin farklılığa nasıl katkıda bulunduğunu ortaya koyarlar, metastasis, veya ilaç direncine nasıl katkıda bulunurlar.

Meydanlar ve Teknik Pitfalls

Onun gücüne rağmen, hücre kültüründe CRISPR düzenleme zorluk çekmeden değildir. Bu zorlukların tanınması ve azaltılması, yenidenroducible sonuçlar için kritiktir.

Off-Target Effects

Cas9, sgRNA'daki yanlış eşleştirmelere tahammül edebilir: DNA duplex, genomda başka yerlerde istenmeyen düzenlemelere yol açabilir. Off-target mutasyonlar yüksek spesifik puanlarla birlikte sgörüntü analizi ve yanlış tahmin edilen düşük maliyetli siteler tarafından hedeflenen sequencing ile.

Düşük İlg Verimliliği

HDR genellikle verimsizdir, özellikle de hücreleri rahatsız eden veya yavaş bölmek için, çünkü donör şablon ve aktif homologer rekombinasyon makineleri gerektirir.Brejik, araştırmacılar S fazda kimyasal inhibitörleri kullanarak hücreler senkronize edebilir (örneğin, nocodazole), NHEJ'yi baskılayan küçük molekülleri kullanabilir veya DNA-Pkcs inhibitörleri gerekir veya Cas9 protein-RNP kompleksini temin edebilir.

Mozaik ve Clonal Variability

Tek hücreli klonlamadan sonra bile, bir popülasyondaki tüm hücreler aynı düzenlemeyi Cas9 veya devam eden onarımın uzun süreli ifadesi nedeniyle taşıyabilir. Bu özellikle de kök hücrelerde sorunludur.

Hücre Toksikliği ve Teslimat Stresi

Transfeksiyon, elektroporasyon ve viral transdüksiyon, DNA hasarı sinyal ve apoptoz dahil olmak üzere hücresel stres yanıtlarını tetikleyebilir.En uygun kurtarma süresini minimuma indirir ve hücre sağlığını artırabilir.

Etik ve Düzenlemeler

Temel araştırma için kültürdeki düzenleme hücreleri standart kurumsal biyogüvenlik ve rekombinant DNA yönergelerine bağlı olarak, çeşitli etik boyutlarda dikkat gerektirir. İnsan iPSC veya embriyonik kök hücreler kullanılıyorsa, kök hücre araştırma denetim komitelerinden daha fazla gözetim gerekli olabilir. Potansiyel tedavi uygulamaları için Somatik hücre düzenlemesi, sorumlu araştırma uygulamaları ile uyumlu olmalıdır.

Future rotası ve Gelişen Teknolojiler

CRISPR alanı hızla gelişmeye devam ediyor. Aşağıda hücre kültürü düzenleme kapsamını daha da genişletmek için vaat eden önemli gelişmeler.

Base Editing

Base editörleri bir kedialitik olarak zayıf Cas9 (nickase) bir deaminaz enzimine, bir taban çiftinin diğerlerine (örneğin, C→T veya A→G) bir DSB veya bağışçı şablonu gerektirmeden, bu teknoloji, yüksek verimlilik ve minimal indel'in yanlarına modellenmesi ve doğru yolojenik SNP'leri modellemek için idealdir.

Prime Editing

Prime editing, bir Cas9 nickase'i ters bir transkriptle birleştirir, hücre kültüründeki bir asil düzenleme RNA (pegRNA) ile birlikte, istenen düzenlemeyi sağlayan bir Cas9 nickase kullanır.

PH Editing ve Organoid Modellerinde

Giderek artan sayıda çalışma CRISPR'ı doğrudan organoidler içinde hücrelere veya düzenleme bileşenlerinin canlı hayvanlara enjekte edilmesiyle uygulanır. Örneğin, AAV ile retina veya karaciğer fare modellerinin teslim edilmesi genetik kusurların düzeltilmesine olanak sağlar.(0) situ).

Birden çok analiz ve Sif Biyolojik Biyoloji

Birden çok sgRNA'ları aynı anda kullanarak, araştırmacılar bir zamanlar çeşitli gen kümelerini sentetik gen devrelerinin yapımına veya poligenik hastalıkların modellenmesine izin verebilirler. MAD7 (Cas12a) nüklease gibi sistemler, bu da kendi CRISPR'ı basitleştirebilir, çok sayıda sentetik gen kümeleri güvenli liman lociye entegre edebilir, biyomanufact için programlama hücresi davranışını açma kapısına açabilir.

Pratik Protokoller

CRISPR düzenlemesini hücre kültürüne uygulamak için aşağıdaki iş akışlarını tavsiye ederiz:

  1. Uygulamalı tahmin algoritmaları kullanılarak hedef başına 3-5 sgRNAs ([Dönetici:0)Doench et al., Nature Biotechnology, 2016[Dönem: 1)
  2. Clone sgRNAs into an expression vektör (e.g., lentiCRISPRv2) veya kimyasal olarak değiştirilmiş sentetik sgRNAs satın alma.
  3. Cas9 ve sgRNA'yı hücre tipiniz için en uygun yöntem aracılığıyla teslim edin ( kök hücreler için ISPONMA elektroporasyon; HEK293T için plazmin.
  4. Düzenleme için 48-72 saat izin verin, sonra genomik DNA'yı hasat edin ve düzenleme verimliliğini tahmin etmek için bir T7E1 veya Surveyor assay gerçekleştirin.
  5. Zengin düzenlenmiş bir seçim işaretleyicisi veya FACS kullanarak hücreler, sonra tek hücreli bir şekilde 96-da plakaya kadar.
  6. PCR ve Sanger sequencing tarafından ekran klonları ve phenotypic geçerliliği için en az iki bağımsız klon seçin.
  7. Hedef düzenlemeyi onaylayın ve sonraki nesil sequencing tarafından üst düzey hedef siteleri kontrol edin.

Detaylı protokoller, [[0)Ekjen'ün CRISPR kaynak merkezi[[Döneticileri, protokolleri ve yönlendirme kılavuzları sunan [Dönlendirme Platformu) için, Broad Institute'un genetik Perturbation Platformu, [2pre-d tasarlanmış sgRNA kütüphaneleri ve analiz araçları.

Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç

CRISPR teknolojisi, kültürdeki hücrelerin değiştirilmesi için vazgeçilmez bir araç haline geldi, araştırmacıların genetik olarak genetik modifikasyonlarla ilgili temel düzenleme ve asal düzenleme gibi yeni araçlar geliştirmesine ve kültürde umut verici bir şekilde doğrulama yöntemleri kullanarak, genetik ve tıpta daha derin öngörüler yapabilmelerine olanak tanır.