Kromatografi, analitik kimyadaki en vazgeçilmez tekniklerden biri olarak duruyor, bilim adamlarının sabit ve mobil aşamalarıyla etkileşimleri ayrı tutmalarına ve karmaşık karışımlarda bileşenleri ölçmek. farmasötik geliştirme, çevresel izleme veya gıda güvenliği testlerine, kromatografinin gücü, sıvı veya gaz etkileşimlerinin sabit bir aşamadan sonra, bu tür bileşikleri sağlam bir şekilde çözme yeteneğine sahip olmakta, bu tür uygulamalarla ilgili temel kavramları daha iyi bir şekilde analiz eder.
Kromatografide Ad Metabolizma Nedir?
Ads Kromatografide, mobil aşamadaki moleküller sabit olmayan bölümlerde bağlayıcı siteler için rekabet eder.Süresel etkileşimin ana kısmı, her bir bileşikin sütunda ne kadar uzun süre kaldığını belirler.
Bir pompanın sudaki dağılımını ayırt etmek önemlidir: 0)ab Metabolizma[Dönetici:0)) Katı veya sıvının (örneğin, normal fazı gibi) yüzeysel olmayan yüzeylerde kalırken, arsadağın asitleri ve ayrılık davranışını yorumlar.
Kromatografideki adsorbat kavramı, katı yazı kullanan Mikhail Tswett'in erken çalışmasına geri döndü.1994'te, kalsiyum karbonat sütunu kullanan fabrika pigmentleri ile ayrılmıştı.
Adpsiyonizminin Mekanizmaları
Kromatografideki adsorbatlar, ana ve istasyonsal faz arasındaki etkileşimlerin doğasına göre geniş ölçüde iki birincil mekanizmaya ayrılabilir: 0,0)fiziksel ad absorpsiyon (fiziksel)[Dönetici)[Döneticisel adsorpsiyon (kimyasal)[Dönetici)[Döneticiler)[Döneticiler)[Döneticiler)[Döneticiler)[Döneticiler)[Döneticiler)[Döneticiler.
Fiziksel Adpsiyon (Physipsiyon)
Fizikiorlar zayıf, rakipsiz olmayan güçlerdir, van der Waals kuvvetleri, dipole-dipol etkileşimleri ve hidrojen bağları. Bu güçler genellikle geri dönüşümlü ve düşük aktivasyon enerjisine sahiptir.Sorular nispeten küçüktir - 5-40 kJ /mol aralığında. Bu, moleküllerin reklamverenb ve desorb'u kolayca ifade edebileceği anlamına gelir, bu da korromatografide avantajlıdır.
Kromatografide fizyoksiklerin örnekleri şunlardır:
- Sihirli olmayan bileşiklerin, Hidrofobik (dispersive) etkileşimleri aracılığıyla ters bir C18 sütunu üzerindeki tutulması.
- Kutup analytes'in silik jelinde normal-faş HPLC'de yüzey silanol grupları ile bağını askıya alır.
- Gaz-solid kromatografisinde göz ardı edilen organik bileşiklerin tutulması.
Çünkü fizyoksiksiyon geri dönüşümlü ve zayıf kuvvetler tarafından yönetilir, sıcaklık, mobil faz kompozisyonu ve sabit faz alanının yüzey alanı ile ilgilidir. Sıcaklık genellikle fizyoksiksiyonu azaltır, ısıtlı enerji zayıf çekici güçleri aşılır - sıcaklık duyarlı analytes için yöntem geliştirmede önemli bir göz önünde bulundurun.
Kimyasal Bağırsak (Chemivitamin)
Chemiorpsiyon, daha güçlü kimyasal bağların oluşumuna sahiptir - avalent veya iyonik - ana ve sabit faz arasında. koremisiyonun entalpirasyonu 40 kJ /mol'den daha yüksektir ve süreç genellikle normal kromatografik koşullar altında geri dönüşümlüdür.Reversible adorpsiyon genellikle analitik ayrılıklar için istenmeyentir (örneğin, örnek kaybı ve sütun kirliliğine yol açar), koreksiyonu kullanımı kolaydır.
Örneğin, postmobilize metal hasinity chromatography (IMAC) tek bir adımda yüksek emisyonlu bir şekilde saflaştırılan proteinlerin krom veya kobalt iyonlarının kromatografisine veya iyonik güce bağlı olarak geri dönüşlerini sağlar.
Yöntem geliştirmesinde, baskın tutma mekanizmasının fizyoksi veya koremisiyon olduğunu bilmek önemlidir. Fizikiorpsiyon temelli yöntemler, çözümü elde etmek için mobil faz kutupitesi ve sıcaklık kontrol gerektirir. Chemior bazlı yöntemler pH, tuz konsantrasyonu ve rakip ajanların lig ve sütuna zarar vermeden basit bir şekilde kontrol etmesini gerektirir.
Adpsiyonel Etkileyen Faktörler
Kromatografideki adsorbatımının verimliliği ve seçimi karmaşık bir faktör oynamasından etkilenmektedir. Bu değişkenleri Mastering, yüksek çözünürlüklü yöntemleri geri kazanmak için anahtardır.
Yüzey Alanı ve İstasyonsal Aşamanın Yapısı
Adorpsiyon bir yüzey fenomendir, bu yüzden sabit fazın belirli yüzey alanı doğrudan bağlayıcı sitelerin sayısını etkiler. Yüksek riskli yüzeylerdeki malzemeler (300-exit500 m2/g) veya göz ardı edilebilir polimerler, daha büyük tutma ve yükleme kapasitesi için daha fazla fırsat sağlar.
HPLC'de, tamamen göz ardı edilebilir parçacıklar (FPPs) yaygındır, ancak yüzeysel olarak göz ardı edilebilir parçacıklar (SPPs), aynı zamanda temel olarak bir uzlaşma teklif eder - ince bir gözlüğü olan sağlam bir temel yüksek mekanik stabilite ve kütle transferi sağlar, ancak daha az genel yüzey alanı.
Analyte'nin Doğası
Moleküler boyut, şekil, kutupluluk ve analitin odak noktası, sabit faz için yakınlığı belirlemektedir. Polar anesteziler (örneğin, alkolik asitler, amines, karboxylic asitler) adsorb sert bir şekilde normal-fayografide ışıklandırmak için. Örneğin, birden fazla hidrokarbonlu gruplar benzer bir miktar adsorpsiyonel-fazorpsiyonel yüzeylere sahip olacaktır.
Ek olarak, sabit sitelere nasıl uygun olduğunu daha kısa tutma yeteneğiyle karşı karşıya kalabilirler - planlayıcı moleküller seçiciliği etkileyebilirler.[Dönetici: 1 ).
Mobile Phase Kompozisyon ve pH
Mobil aşama, adorasyon siteleri için ana olarak yarışıyor. Normal faz kortografisinde, mobil fazın kutupsallığını artırmak (örneğin, sudaki daha fazla mol veya isopropanol ekleyerek) oxane'yi daha güçlü bir şekilde istasyoner aşamasında kutup siteleri için rekabet ediyor, tutma.
pH, 3-4'ün üzerinde pH'da bozulmamış veya homojen tutma (geri dönüşüm) için, temel anestezi grupları (Si-OH) düşük doz (örneğin, pH 2-3), homojenleştirmeye yol açabilir.
Sıcaklık Sıcaklık
Sıcaklık etkileri iki önemli şekilde adsorbat eder: moleküllerin kinetik enerjisini etkiler (profeksiyonun denge sabitini engeller) ve mobil fazdaki vikozları değiştirir.Demokülasyon için, sıcaklık genellikle daha fazla azalır, çünkü zayıf van der Waals kuvvetleri daha kolay bir şekilde aşılır.
HPLC'de sütun ısıtıcıları genellikle sabit sıcaklığı korumak için kullanılır (±0.1 °C) rerodite edilebilir tutma süreleri sağlamak için. Elevated sıcaklıklar (40-60 °C) geniş bir dizi ek basınç artışı ve geri basıncı artırmak, ancak hassas ana-tes veya sabit fazların ısıtılması riskini artırır.
Ionic Strength and Buffer Type
Mobil aşamadaki konsantrasyon ve tür tuzlar, şarj edilen analytes ve şarj yüzey siteleri arasındaki elektrostatik etkileşimleri etkiler.In ion-exchange chromatography, artan tuzlu konsantrasyon (özellikle karşıtlık) transseksüel siteler için en iyi şekilde rekabet eder, tutma ve gradient elution için bir anlam sağlar.
Ters-fay edilebilir bileşiklerin tersine çevrilmeleri için, pH ve iyonik gücü kontrol etmek için bir tampon ekleyerek standart bir uygulamadır. Örneğin,% 0.1 mi formik asit veya 10 mM ammonium format genellikle kullanılır. ancak, bakım alınmalıdır çünkü bazı tamponlar (örneğin, fosfat) organik çözücülerle önceden belirlenebilir ve non-volatile tamponlar kitle spektrometreler için foul spektrometreler.
Yöntem Geliştirme için Implikasyonlar
Adsiyonun mekanizması ve faktörlerini anlamak, bir deneme-ve-terör egzersizinden rasyonel bir optimizasyon sürecine kadar yöntemsel bir optimizasyon sürecine dönüşmektedir. İşte adsorpsiyon ilkelerinden elde edilen pratik stratejilerdir.
Appropriate Stationary Stage'i seçin
İLGİLİ: İLGİLİZCE (CIF) · C18 veya C8 sütunu uygunsa, kutup bileşikleri için, cyano (CN), amino (NH2) veya diol fazları, orta kutup adsorbatımı sağlayan fazları uygundur.Eğer koremisiyonları arzulanırsa - belirli bir proteini yakalamak için - uygun bir lig ve (örneğin, baskı sistemleri ile daha yüksek bir katkı sütunu sağlar.
Normal-fayda korromatografisinde, silik veya ışık sütunları klasik seçimlerdir, ancak basit silik (Type B, yüksek saflık) daha iyirodnabilite sunar. Hybrid stationary steps (e.g., ★-bridged silik) pH aralığını genişletir ve temel bileşikler için yöntem geliştirmeyi basitleştirir.
Mobil Faz Kompozisyonu optimizasyonu
Mobil faz seçimine rehberlik etmek için adsorbat mekanizması kullanın. Ters-faz için, yüksek bir akreple başlayın (örneğin,% 95 su) veya sabit bir fazı azaltmak için ilk ve% 10 arasında ayarlamak için ilk organik bir parçaya ayarlayın.
Normal-faş için, hexane veya her zamantane gibi bir nonpolar çözücü ile başlayın ve kutup değiştirici (isopropanol, ethyl acetate) sütunları ile uyumlu olmasını sağlayın (bu da kutup anası ile çözülebilir).
pH ve Buffer
ionizable bileşikler için, mobil faz pH'ı en az 2 üniteden uzaklaştırın, bir iyonik formda tutmak için (veya geri dönüşümlü veya ion-exchange için şarj) bir tuz gradyan (e.g. 0- MCl) için proteinin pI'si altında olmalıdır.
Sıcaklık optimizasyonu
Sıcaklık kontrolü (örneğin, 30 °C, 40 °C, 50 °C), tutma ve zirve şekli üzerindeki etkisini gözlemlemek için bir sıcaklık ölçümünü yapın. Sıcaklıkta bir fizof-dominant mekanizması olduğunu gösterir.Eğer sıcaklık küçük bir etkiye sahipse veya tutma (rare), koremisiyonelasyonu dahil edilebilir.O zaman verimliliği ve istikrarın iyi bir dengesine sahiptir.
Gelişmiş düşünceler: Bağırsaklık Başkam ve Peak Şekilleri
Mobil aşamada bir ana olarak yapılan bir ilişkinin ve sabit fazdaki konsantrasyonu anİLFLT:0)adorpsiyonun diğeri) tarafından tarif edilir.
En yaygın korromatografideki diğer modeller şunlardır:
- [FONT:0)Langmuir diğerdir: Assumes monokatli bir dizi aynı site ile homojen bir yüzeyde homojen bir çatıya bağlanır.Bu model düşük seviyeli konsantrasyonlarda birçok ters-fayda ve normal-fayda ayrımına uygundur.
- [FONT:0)Freundlich diğerdir:) Bu sitelerin heterojen yüzeylerde multikatlü ad absorpsiyonunu tanımlar. Sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık
- [FONT:0) (Brunauer-Emmett-Teller) diğerdir: ), gaz-solid adsorpsiyona uygulanabilir, ancak bazen mobil faz güçlü reklamçıları sabit bir şekilde sabitlendiğinde sıvı kromatografi ile ilgili olarak, birden fazla tabaka yaratır.
Peak asymmetri (kırlama veya ön cephe) genellikle doğrusal olmayan bir tablonun doğrudan bir ifadesidir. Örneğin, ağır kuyruklama, sabit bir şekilde geri yüklemenin (örneğin, sabit bir yük torbası) veya yüksek çözünürlükte yüksek çözünürlükte yüksek çözünürlükte yüksek çözünürlükte yüksek çözünürlükte bulunan yüksek çözünürlükte bulunan yüksek çözünürlükte bulunan yüksek çözünürlükte bir sütunu kullanarak azaltılabilir.
Köşe verimliliği, teorik plaka sayısı (N), aynı zamanda adsorpsiyon kinetics tarafından da etkilenmektedir. Yavaş adsorpsiyon oranları (mass transfer direnci) zirveleri genişletir. Küçük parçacık boyutları ve daha hızlı akış oranları kütle transferini geliştirir, ancak sadece optimum lineer hıza kadar.
Yöntem Geliştirmede Vaka Çalışmaları
[Dönetici:0)Example 1: Normal bir el biriminde üç kutuplu antioksidanı ayırarak;
)İnisal koşullar (hexane/ethyl acetate 80:20) zayıf bir çözüm ve ağır kuyruklama yaptı (en yüksek çözünürlükte yüzde 60'a kadar) Gausssiyonel asitini bastırmak için % 0.1 oranında azalttı (ve) diğer tüm bileşiklerde demetti.
[FONT=0)Example 2: Bir His-tagged recombinant protein IMAC
) Ni-NTA sütunu, bağlayıcı tampon ile equilibrated, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 7.4).
Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç
Bağırsak tek, monolithic bir süreçtir; bu, zayıf, geri dönüşümlü van der Waals güçlerinden güçlü, seçici kovalent bağına kadar bir araya gelir. Kromatografide, ve mobil faz ortamının hangi tür adsorpsiyonların tutmasını fark etme yeteneği - ve sadece başarılı değil, aynı zamanda sağlam transferlerin ve ölçeklerin geri kalanının daha hızlı bir şekilde tanımlanması.
[0] Daha fazla okuma için Dış kaynaklar:
- [FONT:0)Sigma-Aldrich: Ad Metabolizmaografi İlkeleri).
- [FONT:0) BilimDirect: Bağırık Kromatografi Genel Bakış).
- [FONT:0)ACS Analytical Kimya: Adorasyona Dayanlı Ayrılmalarda Son Gelişmeler).
- [FONT:0)LCGC: Ad Metabolizma Chromatography (Part 1)).