Hücre kültürlerini geliştirmek, özellikle aşılar, monoklonal antikorlar ve diğer protein temelli tedaviler gibi biyolojik ürünler için endüstriyel ölçekler sağlamak için yeterli ürün verimini sağlamak, biyofarklı endüstrideki büyümeye devam etmek, yıllık satışlarda 200 milyar dolardan fazla miktarda artırmak, ölçeklendirme sürecine sahip olmak gibi biyokütle antikorları geliştirmek için, rekabetçi bir gereklilik haline getirmek.Bu makale, ilkelerin, sorunların ve en iyi teknik bir bakış açısı sağlar.

Hücre Kültürünin Temel Prensipleri Ölçeği-Güncel

Scale-up sadece hacimde lineer bir artış değildir; ulaşım fenomenleri, hücresel fizyoloji ve mühendislik kısıtlamalarının dikkatli bir şekilde dikkate alınması gerekir. Aşırılık hedefi, en iyi hücre büyümesini ve protein ifadesini daha büyük ölçeklerde destekleyen mikrodövme anlamına gelir. Anahtar ilkeleri geometrik benzerlik, boyutsuz parametre eşleştirme ve birim hacmi başına sürekli hacimsel oksijen transfer oranlarının (kLa) veya güç girişinin geri alınmasıdır.

Geometrik benzerlik, biyoreactor boyutlarının oranını tutmayı içerir (height-to-diameter, hardeller-to-tank çapında) sürekli olarak, bu basit hesaplamalar, genellikle ölçeklendirme ile değişir, çünkü mühendisler genellikle sabit kLa'ya dayanan ölçeklendirme kriterlerini kullanır, sabit bir şekilde hız (toplayıcıya göre), veya sürekli karıştırılmış zaman için 10 ila 40 arası hücreler için kullanılır.

Başka bir kritik ilke, Reynolds sayısı, Power numarası ve Froude gibi boyutsız sayıların kullanımıdır. Bu sayıları tanımlı bir aralıkta korumak için mühendisler karıştırabilir, oksijen transferini ve daha büyük ölçeklerde beklerler. Ancak, tek bir parametre ölçekleri mükemmel bir şekilde, bu yüzden kriterin bir kombinasyonu ve iteratif pilot denemeleri önemlidir.

Tohum Treni: Flask'tan Prodüksiyon Bioreactor

Tohum 106, bir çalışma hücresi bankasından (WCB) oluşan hücreli bir genişleme, daha sonra yeterli biyokütleler üretinceye kadar, 1 L spinner flasks, 10 L dalga torbaları, 100 L tohum biyoreactors ve sonunda bir 210.000-10.000-d üretim Lreactor ile başlayabilir.

Tohum treni tutarlı üretim için çok önemlidir. Hücreler, büyüme aşamasına kadar gecikme aşamalarından kaçınmak ve yüksek viability (>% 90) Kontrol etmek için yüksek çözünürlükte (tipik olarak 0.2-0.5 × 106 hücreler / geçiş süresi (her 3-4 gün) ve orta kompozisyonu genişletmek için genişleme boyunca üst düzeye kadar, aşırılıkta oksijen sınırlamalarını önlemek için ayarlanmalıdır.

Tohum trenlerini kolaylaştırmak için, birçok üretici, kontraseptör üretim koşullarını sağlayan gelişmiş kontrol sistemleri ile tohum biyoreactors'u kabul ediyor. orta hücre bankalarının kriop korunması da geçiş sayısını azaltabilir ve tutarlılığı artırmak. Son yenilikler, otomatik hücre kültürü sistemleri ve kapalı, tek kullanımlık tohum trenleri içerir.

Bioreactor Selection ve Tasarım

Doğru biyoreactor tipi seçmek, ölçeklendirmede önemli bir karardır. Üç ana kategoriye (STR) karıştırılmış biyoreactors (STR), dalga kaynaklı hareket biyoreactors ve sabit yatak veya paketlenmiş yatak biyoreactors. Her biri hücre tipine, ürüne ve süreç gereksinimlerine bağlı olarak farklı avantajları sunar.

Stirred-Tank Bioreactors

Stirred-tank biyoreactors, büyük ölçekli üretim için endüstri standardıdır, özellikle de süspansiyonlu mammalian hücreler için. Sürekli kLa'yı korumak için, ve oksijen transferini bir darbe ve avansiyon oranıyla arttırmak için, hear'ı hidrofoil, veya denizler kullanarak yönetmek için.

Disadvantages, paslanmaz çelik gemiler için yüksek sermaye maliyetleri, temizlik ve sterilizasyon gereksinimleri ve uygun şekilde tasarlanmamışsa oar hasarı için potansiyel. Single-use mixred-tank biyoreactors, mevcut 2.000 L'ye kadar, esnekliği ve geri dönüş süresini azaltır, onları klinik üretim ve multiproduct tesisleri için popüler hale getirir.

Wave-Indüktör Hareket Biyoreactors

GE WAVE veya Sartorius Biostat CultiBag gibi dalga biyoreactors, kültürleri nazikçe karıştıran ve gaz transfer kısıtlamaları olmadan gaz değişiminin sınırlı olduğunu ortaya çıkarmak için bir kayalık platformu kullanabilir ve yüksek hacimli kültürler için uygun değildir.

Sabit-Bed ve Packed-Bed Bioreactors

Sabit biyoreactors, yüksek hücreli dağıtım gerektiren ürünler için kullanılır (örneğin 108 hücre / L) ve sürekli perfüzyon sağlar.Onlar virüs üretimi için uygun hale getirir (örneğin, aşılar) ve bazı rekombinant proteinler.

Anahtar Parametreleri ve Onların Scaling

Başarılı ölçeklendirme, laboratuvardan üretim ölçeklerine kabul edilebilir aralıklarda önemli kültür parametrelerini korumak zorundadır. En kritik parametreler oksijen transferini, karıştırılmasını, stresi, pH ve sıcaklık içerir.

Oksijen Transfer ve kLa

Atomik oksijen transfer katsayısı (kLa) aerobik kültürlerdeki en önemli parametredir. mammalian hücreler için, 10-30 h -1'in yüksek yoğunlukta mikropiyal kültürler için, 100 h'nin üzerinde değerler, daha büyük ölçekli, yüzeysel hızları kullanarak, mikropürücüklerden (örneğin, yüksek oranda köpük ve hear hasarlar) gerekli hale gelir.

Mix ve Homogeneity

Mix zamanı, besinlerin üniformasını, pH ve sıcaklıklarını sağlamak için kritiktir. 10.000 L reaktörde, karıştırma süreleri, daha düşük sertler için tank çapına kadar 30-60 saniye olabilir. Sık sık sık sık karıştırılmış hücreler kullanır. Impeller tasarım ve numara, baffles, ve gemi geometrisi tüm strese karşı dengelenir.

Shear Stres

Shear stresi, agitation, sparging ve balonu sıvı yüzeyde rupture'den ortaya çıkar. Mammalian hücreler genellikle to 0,5-1 Pa'ya kadar strese dayanabilirken, püronik F-68 (0.1-0.2 w/v) gibi mikropişmanlar, potansiyel olarak zarar vermezler.

pH ve Sıcaklık Kontrol

pH kontrolü CO2 sparging (daha düşük pH için) ve temel ek ( pH'ı yükseltmek için) ölçeklendirmede, gradients yerelize pH aksanı neden olabilir. Sıcaklık ceketler veya iç bantlar ile kontrol edilir ve daha büyük gemiler daha yavaş ısı transferleri vardır; pre- ısıtma medyası ve sürekli izleme önemlidir.

İzleme ve Kontrol Stratejileri

Gerçek zamanlı izleme ve otomatik kontrol, tutarlı kültür koşullarını ve ürün kalitesini korumak için vazgeçilmezdir. Modern biyoreactors, oksijen (DO), pH, sıcaklık ve turbidity (aslıyom yoğunluğu için bir proxy olarak).

Process Analytical Technology (PAT), alg ve lactate seviyeleri ile desteklenen olarak, Raman spektroskopu veya dielektrik spektroskopi kullanılarak uygulanabilir hücre yoğunluğu ve metabolik durumu tahmin etmek ve model tabanlı kontrol için gerçek zamanlı kontrolleri vurgulamak için gerçek zamanlı kontroller vurgular. Örneğin, bir besleme kontrol için, bu, otomatik besleme algoritmaların farmasötik ve spektif olarak ölçümleme seviyelerinin uygulanması anlamına gelir.Örneğin, pilot işlerden tarihi verileri içeren bir metabolik grip modeli ile ilgili olarak tahmin edilebilir.

Perfüzyon kültürü, taze orta sürekli eklenmiş ve harcanan orta, hücreler muhafaza edilirken (görüntü veya akustik yerleşimciler) daha sıkı hücre tutma verimliliğini ve atık metabolit seviyelerini izlemesi gerekir. perfüzyon proseslerinin ölçeklendirmesi özellikle zor çünkü filtre alanı ve akış oranları pıhtılaşma ve hücre stresinden kaçınırken artan hücre kütle ile eşleşmelidir.

Scale-Up'daki Zorluklar ve Çözümler

Dikkatli planlamaya rağmen, çeşitli tekrarlanan zorluklar ölçeklendirme çabaları:

  • [FONT:0)Oxygen Limitasyon: [Dönergede Büyük Gemilerde, kütle transferi, baz oksijen ve makro-zenginleştirilmiş hava kullanarak, veya kontrol edilen basıncın altında ısınabilir.
  • [FONT:0)Nutrient Gradients:[Döneticileri) Büyük hacimlilar, kan şekeri, amino asitler ve büyüme faktörlerini geliştirmek için konsantrasyon sağlar.
  • [FONT:0)Contaminasyon:[Dönetici: [Dönetici: 0,3) Mikrobiyomzyumun riski ölçekle artar.Tek kullanımlık biyoreactors bunu temizleme ve sterilizasyon adımlarını ortadan kaldırarak azaltır. paslanmaz çelik, titiz temizlik-in-place (CIP) ve sterilizasyon-in-place (SIP) protokolleri zorunludur.
  • [FONT:0)Shear Hasarı:[Dönlenenler için , hear, hear koruyucularının yanı sıra, gelişmiş aerasyon hızlarında daha düşük agitation hızlarında çalışır. Bazı üreticiler hücre hattı için "s prova stres eşikiği" uygularlar, iyi kontrol edilen küçük ölçekli deneylerde bir rheometer veya mikrofluidic cihazı kullanarak.
  • [FONT:0)Process Variability:[D)[D)[D) <> Batch-to-batch variability, tohum tren tarihindeki farklardan, medya çok veya çevresel koşullar altında kullanılabilirlik (QbD) bir çerçevede tanımlanabilir.

Birçok ölçeklendirme zorluğuna çıkan bir çözüm, büyük ölçekli işlere karşı taahhüt etmeden önce ölçeklendirme modellerinin (SDMs) kullanımıdır. SDMs, ölçeklendirmedeki başarısızlık riskini önemli ölçüde azaltır. SDMs, yüksek oranda işlem koşulları, besleme stratejileri ve hücre hatlarının yüksek oranda testlerine izin verir.

Süreç Geçerlilik ve Düzenlemeler

FDA ve EMA dahil olmak üzere düzenleyici kurumlar, ölçeklendirme sürecinin tutarlı ürün kalitesini ve güvenliğini sağlamak için doğrulandığını gerektirir. Bu genellikle pilot ölçekte üç ila beş tane eşdeğerli toplu içerir (10-20% üretim hacmi) işlem tekrarlanabilirlik göstermek için. Anahtar doğrulama çalışmaları şunları içerir:

  • [FONT:0)Comparability:[Dönetici:[Dönetici:0)[0)Comparability:[Dönetici:[Dönetici: 0) Bu, HPLC, kütle spektrometrisi ve biyoassays gibi analitik yöntemlerin bir paneli kullanılarak yapılır.
  • [FONT:0)Process Robustness:[Dönetici:[Dönetici:0) CPP'lerde (örneğin, agitation speed) tasarım alanını tanımlamak için gerekli değişiklikleri test edin.
  • [FONT:0)Cell Büyüme ve Verimlilik:[Dönetici: 1) Bu hücreye özgü verimlilik (qP) ve uygulanabilir hücre yoğunluğu profilleri önceden tanımlanmış aralıklardadır.

Eleştirel bir düzenleyici beklenti, ölçekdeki herhangi bir değişiklik bilimsel gerekçe ve veriler tarafından desteklenmelidir. Örneğin, 200 L tek kullanımlık biyoreaktörden 2.000 L paslanmaz çelik reaktöre kadar ayrıntılı bir karışım, ısı transfer ve gaz transfer özellikleri ile ilgili olarak daha fazla kabul edilir.

Ayrıca, endüstri sürekli üretime doğru ilerliyor, hücre içi konfüzyon biyoreaktör doğrudan alt kodlamaya bağlı olarak hücre konsantrasyonunu korumak için orantılı olarak ölçeklenmiş durumda. Sürekli üretim için Scale-up, maliyet ve ürün tutarlılığını azaltabileceğini göstermiştir.

Gelişen Teknolojiler ve Gelecek Yollar

Hücre kültürü ölçeğinin alanı, daha büyük verimlilik ve esneklik vaat eden yeni teknolojilerle hızla gelişmektedir:

  • [FONT:0) Tek kullanımlık Biyoreactors (SUB) kullanılabilir: [FONTT:0) 5.000 L'ye kadar kullanılabilir, SUB, çapraz şarj riskini azaltır ve geçerliliğini ortadan kaldırır. ölçeklenebilirlik, tek kullanımlık torba tasarımına ve tutarlı film özelliklerine bağlıdır.
  • [FONT:0)Farklı Tohum Trenleri: Kapalı sistemli tohum trenleri steril bağlantıları ve tek kullanımlık flasks manuel müdahaleleri azaltır ve daha hızlı bir şekilde geri dönüş sağlar.
  • [[Dönetici ve Makine Öğrenmesi:[Dönetici:0) Tarihi süreç verileri üzerinde eğitilmiş temel modeller, yem oranları ve hasat süreleri dahil olmak üzere optimal ölçeklendirme stratejileri önerebilir. Dijital biyoreactors dijital ikizleri uygulamadan önce ölçeklendirme senaryolarını simüle eder.
  • [FONT:0) Yüksek Boyut Perfüzyon: Yeni hücre tutma teknolojileri, akustik dalga ayırıcıları ve geri dönen sental filtreler gibi, hücre dezenlerinin 108 hücreden üzerindeki altları / 10 kata kadar biyoreaktör hacmi gerekliliklerini azaltın.
  • [FONT=0)Cell Line Engineering:[DÜDÜT:1] Özel-mühendislik hücreleri sialidaz veya lactate dehidrojenaz için genlerde depolanmış veya yüksek yoğunlukta atık birikimini azaltabilir ve üretkenliği artırabilir, ölçeklendirme ölçeklendirme.

Bu yenilikler endüstriyi daha küçük, daha esnek tesislere ve yeni biyologiclere daha hızlı zaman pazarlamaya götürüyor. Ancak, büyük ölçekli hücreler için homojen, sağlıklı bir ortam, biyokimyasal mühendisler ve biyoişlem bilim adamları için temel bir odak noktası olmaya devam ediyor.

Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç

Başarılı bir şekilde hücre kültürlerini ölçeklendirmek ve işlem için önemlidir - yüksek kaliteli ilaçlar verimli ve güvenilir bir şekilde üretebilir. PAT, QbD ve tek kullanımlık sistemler gibi gelişen teknolojiler her adımı dikkatlice yöneterek - tohum tren genişleme ve biyoreactor seçimine devam edecek, endüstriyi tutarlı ve güvenli bir şekilde karşılamak için.