Hızlı Reaksiyonların Ölçülmesinin Meydani

En önemli kimyasal ve biyolojik süreçlerin çoğu zaman milisaniye, mikrosaniye veya daha hızlı olan olayları çözemez. Enzyme kediiz, protein katlama, ligand bağlayıcı ve elektron transfer reaksiyonları, tüm son derece yönlü ve yaygın bir şekilde kullanılan araçların göz ardı ettiği, en çok kullanılan yöntemlerden biri olarak ortaya koyar.Süresel algılama, hızlı reaksiyon kinetiği, bilim adamları, düşük zaman zamanlayıcısı algılama ile tam zamanlı olarak karıştıran bir dizi hızlı tepki gösterdiler.

Durmuş-Flow Tekniki Nedir?

Durak tekniği, bir milisaniyenin bir kısmını yeniden üretip, bir hücreye doğrultulan ve daha basit bir şekilde, iki veya daha tepki veren çözümler, bir mola veya kapaktan sonra ayrı bir şekilde kapatılır ve bir araya getirildiğinde, bir mikropiyonel çözümün bir kısmını gözlem bölgesinde etkili bir şekilde karıştırır ve bir şekilde bir şekilde değiştirir - bir şekilde sertleştirici bir şekilde sonuçlanır.

Başlangıçta 1940'larda gelişmiş ve sonraki on yıllar boyunca incelenmiş, durgunluk aracılık, bilgisayar kontrollü, çok hassas cihazlarla çok fazla dalga uzunluğundaki algılamayı mümkün kılar. Modern aletler rutin olarak iki milisaniye kadar (toplama ve veri satın alma zamanı) ile bu sınırın altında tutabilir ve özel mikrofloresaniye versiyonları bu sınırı 100 mikrosaniyenin altına alabilir.

Nasıl Durulur-Flow Çalışması?

Durmuş bir akış cihazın temel işletim döngüsü birkaç farklı aşamaya ayrılabilir:

  1. [FONT:0)Loading:[[Dönetici:[Dönetici:0) Reaktör çözümleri iki veya daha fazla sürücüye yerleştirilir. Bu ringler genellikle sürekli bir sıcaklık korumak için termostateddir.
  2. [FONT:0]Driving:[Driving: Bir pnömatik veya mekanik sürücü sistemi aynı anda ileriye doğru itiyor, küçük bir karıştırma odasına tepkileri zorlar.
  3. [FONT:0)Mixing:[Dönetici Odasında, tepki verenlerin akışları, T-jets, dört-jet somut tasarımlar ve top karıştırıcılar içerir, her biri 100-500 mikrosaniye içinde tam karıştırılır.
  4. [FONT:0) Gözlem hücresineFlow:[Dönetici:[Dönetici:0) Komplikeli çözüm gözlem hücresinden geçer - optik pencerelerle küçük hacimli cuvette. Hücre hacmi tipik olarak bir litrenin bir kısmıdır.
  5. [FONT:0) Dur ve veri alımı:[Dönetici:[Dönetici:0)))))Pekin bir başlangıç sınırına ulaştığında, bir geçiş iki olayı tetikliyor: akış durduruluyor ve veriler kayıt oluyor. Çünkü son zamanlardaki düşüş şu anda sabit, reaksiyon karışımı şimdi sabit, ve dekürücükler kinetik veriler toplamaya başlıyor.
  6. [FONT:0]Wash ve tekrar:[[Dönetici:[Dönetici:0)[Dönetici:0)Düz ve tekrarlama:[Dönetici:[Dönetici:0)[Dönetici:[Dönetici:))) Veri toplamadan sonra, gözlem hücresi ve karıştırma odası tampon veya bir sonraki örnekle kızarılır ve döngü tekrarlanır ve tekrarlanır ve tekrarlanan ölçümler veya farklı koşullar için döngü tekrarlanır.

Bir Durped-Flow Instrument

Her bir bileşenin rolünü anlamak, tekniğin gücünü ve sınırlamalarını teşvik eder.

  • [FONT:0]Drive sempati ve eylemci: Sürücü sabit, reproducible flow speed.Locks yaygındır; stepper motorlar, kesin hacim kontrolü gerektiren sistemlerde kullanılır.
  • [FONT:0)Mixing odası: [Dönetici: 0:0) Kompiyonun verimliliğinin ölü zamanı belirlediğini varsayar. Yüksek kaliteli karıştırıcılar hızlı homojenliğe ulaşmak için küçük kanallarda çalkantılı akış kullanır. Dead times are often to detection of a standard (e.g., the response of 2,6-dilorolindoolololololololololololololol
  • [FONT=0)Observation cell:[Dönetici:[Dönetici:0))) Tipik olarak 1-10 mm'lik bir yol uzunluğu ile, hızlı optik erişim için tasarlanmış.
  • [FONT=0)Deteksiyon sistemi: [DDDDs) veya fotodiode dizileri ışık yoğunluğunu izlemek için kullanılır. Bir monokkromatör veya filtre uygun dalga dalga dalgalar aynı anda diyot dizileri veya şarj cihazı ile birden fazla dalga dalga dalga dalga dalga dalga dalga dalgalar kaydedebilir.
  • [FONT:0) Durgun ve tetikleyici:[Dönetici: 0) Durgun bir arka baskı sağlar ve mekanik bir tetikleyici olarak davranır. Bir optik veya elektrik sensörü durdurmayı ve veri satın almayı en az gecikme ile başlatır.
  • [FONT:0]Temperyature kontrolü: [Dönetici: [Dönetici] Tüm sıvı yol - genellikle sabit sıcaklığı korumak için dolaşıma bağlı bir blokta kapalıdır (genellikle 20-25 °C, ancak çeşitli olabilir).
  • [FONT=0)Data Acquisition sistemi:[Dönetici:0) Yüksek hızlı analog-dijital dönüştürücüler, kilohertz'dan megahertz'a kadar ölçümlerde, saniyede yüzlerce veya binlerce veri noktası ele alır.

Durped-Flow ile Hızlı Reaksiyon Kinetics'i Ölçün

Türleme Oranı Transient Data Constants from Transient Data

Çiğ kinetik izlerinin -bir proteinin akıtılması veya zaman karşılaştırıldığında floresans-maliyetin analizinde, doğrulanmış bir kinetik modeller kullanılarak analiz edilir. #[Dönemli bir tepki için, örneğin, [Düzükler[Dönersiz tepkiler için, izoleksiyonlar, izoleksiyonlar, gözlemlenen bir düşüş veya artıştır.)

İki adımlı bağlayıcı veya enzim kataliz (Michaelis-Menten kinetics) gibi daha karmaşık mekanizmalar, farklı koşullar altında toplanan birçok ize sahip olmak için kullanılır. Software paketleri (e.g., KinTek, Biologic, veya QtiPlot gibi açık kaynak araçları) önerilen mekanizmadan elde edilen tüm oran denklemleri uygun olarak kullanılır.

Durak deneylerdeki önemli bir parametre, hızlı fazın amplitüdünü, potansiyel olarak kinetik analizde hataların yol açtığı anlamına gelir. Ölü zaman genellikle üretici tarafından belirlenir.

Analiz Yöntemleri

Tespit yönteminin seçimi, tepkinin incelendiğine bağlıdır:

  • [FONT:0)UV-Visible absorbance:) Kromozofor konsantrasyonunda değişiklikler içeren tepkiler için uygun. -e.g., enzimlerde veya ligde substrat ciro ve emeğe bağlı değişiklikler.
  • [FONT:0)Fluorescence:[Dönetici:[Dönetici: 0) Çok daha hassas, düşük konsantrasyonlar ve intrinsic veya extrinsic fluorofores (örneğin, proteinlerde, dansil etiketlerde) içeren reaksiyonlar için idealdir.
  • [FONT:0)Circular dichroism (CD) ve optik doğrusal doğrusal dağıtım (ORD): [D: ), protein katlama veya ortaya çıkan değişiklikler takip etmek için kullanılır.
  • [FONT=0)Işık saçı:[Dönemli:[Dönüşük/kürüm) Birleştirme veya polimerizasyon reaksiyonlarını izlemek için kullanışlıdır.
  • [FONT:0)Electrokimyasal tespit:[Dönetici:[Dönetici:0) Daha az yaygındır, ancak elektrotları içeren özel hücrelerle mümkün.

Durmuş-Flower'in Avantajları ve Sınırları

Avantajları Avantajları Avantajları Avantajları

  • [0] Yüksek zamansal karar:[Dönemli 1-2 ms) Ölü zaman 1-2 ms, manuel karıştırma ile takip edilemeyen hızlı süreçleri gözlemleyebilmelerine izin verir.
  • [FONT:0) Gerçek zamanlı izleme:[Dönemli izler, sadece uç nokta ölçümlerini değil, tam kinetik profiller sağlar.
  • [[0)Minimal örnek tüketimi: [Dönetici başına toplam hacimler 50-200 μL ve birden çok tekrarlar küçük miktarlarla yapılabilir.
  • [FONT:0)Versattitude:[Dönetici:[Dönetici:0) Geniş bir dizi algılama modları ve örnek türleriyle uyumlu olarak; dağıtım, süspansiyonlar ve hatta bazı membran preparatları.
  • [FONT:0]Temperature kontrolü: [Dönetici: Tüm sistem termostatize edilebilir, sıcaklık bağımlılığı ve Arrhenius analizinin çalışmalarına izin verebilir.

Sınırlamalar

  • [FONT:0)Dead zaman sınırı: [Dönder: 1) Reaksiyonlar, ~1 ms'ten daha hızlı çözülemez; ilk patlama kaybolur. sub-millisan kinetics için, flaş fotolysis veya sürekli akış yöntemleri gibi diğer teknikler gereklidir.
  • [FONT:0)Mixing eserler: [Dönetici: 1) Tamamlanmamış veya non-reproducible Mix, temel bozulmalara veya titiz sinyallere yol açabilir. Dikkatli kalibrasyon ve karıştırıcı geometri seçimi önemlidir.
  • [FONTcal eserler:[Dönetici indeksi) Kompiyon üzerine yapılan değişiklikler temel atlamalara neden olabilir, özellikle farklı kompozisyonların çözümlerini karıştırırken.
  • [FONT=0)Flow-indüktör etkileri:[Dönetici:[Dönetici:0) Yüksek hear kuvvetleri karıştırılmış mayınozlar bazı hassas makromoleküler meclisler, ancak bu nadiren küçük proteinler ve enzimler için bir problemdir.
  • [FONT:0] çözümün-fayını yeniden ifade etti: Durped-flow öncelikle sıvı örnekleri için tasarlanmıştır; sağlam devlet veya çok vius örnekleri zorlanır.

Stopped-Flow Across Science

Enzyme Kinetics ve Mechanism

Sabit akış spektroskopu, katalitik döngüdeki bireysel adımları ortaya koyan bir enzimi substratına karıştırarak ve ürün oluşumunu veya kofaksiyon emiciliğini kullanarak, araştırmacılar, katalitik döngüdeki adımları ortaya çıkarabilirler.[örneğin, ürün formasyonunun ilk birkaç milimetresi ve enjeksiyonu)

Protein katlama ve Unfolding

Protein katlama dinamikleri çalışma, katlanma reaksiyonlarının hızlı bir şekilde başlatılmasını gerektirir. Tipik bir durgun deneyde, yapısal değişikliklerde ortaya çıkan bir protein çözümü (örneğin, yüksek denaturant konsantrasyon) hızla geniş bir aşırılık varlığıyla karıştırılır, tekrarlanan bir fluometalik sırasında, küçük globünlerin yollarına veya ekspertize edilen proteinlerin bozulmasına neden olur.[TFL:0)

Ligand Binding ve İlaç Keşif

İlaçların veya doğal liglerin oranlarının azaltılması farmakolojide kritiktir. Durmuş-kanıklık fluorsanları, ilaç keşiflerinde meydana gelen bağlayıcı olayları çözebilir. Teknik, basit bir bimolecular mekanizmasının veya uygun bir şekilde değiştirileceğini belirlemeye yardımcı olur.[4] Bu tür bilgiler, ilaç tasarımının optimize edilmesi ve tükenen ilaçların tasarımını içerir.

Hızlı Kimyasal Reaksiyonlar

Örneğin, metalik ve organometalik kimya, durgun bir metal kompleksini durdurmak için kullanılır, metal-oxo ortalarının oluşumu da gözlemlenebilir.Örneğin, katalitik hidrojen veya polimerizasyon mekanizması, metal komplekslerinin erken aşamalarını gözlemleyerek çok hızlı bir şekilde azaltılabilir.

Biyolojik Makromoleküllerdeki Değişimler

Protein katlanmasının ötesinde, birçok biyolojik fonksiyon, lig ve bağlayıcılık tarafından tetiklenen uyum geçişleri içerir, pH değişikliği veya sıcaklık atılır.Kanser dichroizm veya FRET ile bir araya getirilir (Förster resonance enerji transferi) bu hareketleri çözebilir.Bu hareketleri RNA ve DNA katlamaları için de özellikle de göstermiştir.

Son Güncellemeler Durped-Flow Teknolojisi

Microfluidic Durped-Flow

Mikrofluidic çiplere son verme ilkelerinin entegrasyonu 100 μs altında ölü kez itti. Mikrofluidik cihazlarda, laminar Mix, uzmanlaşmış kanal geometrilerini kullanarak kaotik olarak kabul edilir. Bu sistemler daha düşük örnek hacimler (nanyucular) ve mikrofluidik tarama için analiz edilmiştir. Araştırma grupları hızlı bir şekilde karıştırılmış enzim kinetiği ve proteinleri kullanarak proteinleri kullanarak analiz eder.

Yüksek Hızlı Giriş Yapıldı -Flow

Reaksiyon oranları ve aktivasyon hacimleri üzerindeki baskı etkisini incelemek için, yüksek hidrostatik baskılar altında (birkaç yüz MPa kadar) çalışmak için durduruldu. Bu sistemler proteinlerin stabilitesini ve aşırı koşullarda bulunan mekanizmaları anlamak için paha biçilmezdir.

Ağo- Durdu-Flow

Alt-zero sıcaklığı durduruldu (örneğin ağlamak-stoplanan-girme) araştırmacıların filoyu tespit etmek için yeterince hızlı tepki vermelerine izin verir.Bu yaklaşım özellikle de enzim kediiz ve fotokimyasal tepkiler ile ortalar karakterize eder.

Diğer Hızlı Kinetics Teknikleri ile Karşılaştırma

Durmuş-giriş hızlı tepkileri incelemek için birkaç yöntemden biridir; her biri kendi güçlü ve sınırlamaları vardır:

  • [FONT:0) Sürekli akış:[Dönemli:[Dönder:[Dönder:) Rejimler, uzun bir tüp ve veriler, tüpün boyunca farklı pozisyonlarda ölçülmektedir, karıştırdıktan sonra farklı zamanlardan farklı olarak. Sürekli akış çok kısa ölü zaman (mikrosaniyeler) sunar, ancak daha az örnek kullanır ve uygulamak daha basittir.
  • [FONT=0]Flash fotolysis / lazer fotolysis:[Dönder:[Dönemli) Bir tepkiyi tetikleyecek kısa bir lazer darbe kullanın (örneğin, kafesli bir bileşik için dissociation of a kafesd bileşik).
  • [0]Temperature-jump (T-jump): [Dönemli bir lazer veya deşarj kaynaklı sıcaklık artışı ( nanosaniyelerde yüksek dereceler) dengeyi rahatlatır ve dengeye geri döner. T-jump hızlı uyum değişiklikleri okumak için mükemmeldir, ancak dengeye bağlı olarak sistemlerle sınırlı.
  • [FONT=0)Quenched-flow:[Dönemli bir gecikmeden sonra, reaksiyon sert bir reagent (e.g., asit) ekleyerek gider ve ürünler çevrimdışı olarak analiz edilir. Quenched-flow sürekli gerçek zamanlı veriler sağlayamaz; dur-giriştir.

Bir Durped-Flow Deneyi kurmak için Pratik Bakış

Durak bir akış aracından güvenilir kinetik veriler elde etmek deneysel tasarıma dikkat gerektirir:

  • [FONT:0)Buffer ve iyonik güçten memnun kalacaklar: Çözümleri, eserlere neden olabilecek hava balonlarından kaçınmak için filtrelenmiş ve begasslenmiş olmalıdır.
  • [FONT:0) Ölü zamanınızın belirlenmesi:[Dönetici:0) Aracınızın ölü zamanını her zaman standart bir tepki kullanarak (örneğin, DCPIP ve ascorbate arasındaki reaksiyon) Ölü zaman önce dış noktalarınızı dengelemek.
  • [FONT:0) Kontrol deneyleri:[Dönetici:0) Bir "kanı" kontrolü (kendileriyle aynı çözümü karıştırarak) temel stabilite için kontrol etmek için. Ayrıca, reaksiyon farklı akış hızlarında karşılaştırmak suretiyle sınırlı olmadığını doğrulama.
  • [FONT:0)Data averating:[[Dönetici: 0) Genellikle 5-10 replikler sinyal-to-noiseyi geliştirmek için ortalama olarak yapılır. Ancak, reaksiyonun tekrarlanabilir ve tekrarlanan deneyler sırasında fotobleaching veya örnek bozulmanın meydana gelmesini sağlar.
  • [FONT:0]Temperyatür kontrolü: [Dönetici: [Dönetici:0] Sıcaklık duyarlı reaksiyonlar için, 1 °C bile hız sabitlerini önemli ölçüde değiştirebilir.

Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç

Hızlı reaksiyon kinetiğinin incelenmesini durdurmak için araştırmacıların milisan bariyerinin ötesinde gizli olan süreçleri gözlemlemelerini sağlamak. enzim mekanizmaları ve proteinler ilaç keşfi ve malzeme bilimi ile pratik uygulamalarla katlanmak, durdurulan herhangi bir bilim insanı için gerekli bir araç olmaya devam edecektir.

Daha ileri okuma için, son derece zorlayıcılar, Fersht, 03.D:0)Structure ve Mechanism in proteinler) veya inceleme yazısı [DDDüzgT:2)) tarafından kullanılan "Expture" (İngilizce).