Ters-Phase HPLC ve Mobile fazının Rolü

Ters-fay Yüksek-Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) farmasötik, çevresel, biyokimyasal ve gıda analiz laboratuvarları arasındaki en çok yönlü ve yaygın bir ayrım tekniğin biri olarak kalır. Yöntem, ana-tapsiz bir faza dayanır; daha fazla hidrofobik bir bileşik, daha uzun süre muhafaza edilir.

İstasyonsal faz kimyası ve sütun boyutları yöntem geliştirme sırasında sabitlenirken, mobil faz kompozisyonu, organik çözücü tipi, organik-to-su oranı, tampon pH, iyonik güç veya modlamaların eki, yüksek çözünürlükte en büyük esnekliği sunar.

RP-HPLC'de Kararın Teorik Basis

Karar (R[DÜ:0)[Dönetici: 1) İki bitişik zirve arasındaki karar temel denklem tarafından tanımlanır:

[FONT:0) R[DÜT:2)[[FONTN/4) × (α- 1) × (k) = (k) = ( + k)).

N'nin sütun verimliliği (kahraman numarası), α iki anali arasında seçim faktörüdür ve k' daha sonraki topun tutma faktörüdür. Mobile faz kompozisyonu doğrudan üç terim içerir:

  • [FONT:0)Efficiency (N):), öncelikle sütun kalitesi ve akış oranı tarafından belirlenirken, mobil faz viskobu ve katkı konsantrasyonunu etkileyebilir ve böylece plaka yüksekliği etkileyebilir.
  • [FONT:0) Seçicilik (α):[Dönetici için tutma faktörlerinin oranı mobil faz kompozisyonuna son derece hassastır, özellikle organik bir çözücü ve pH türü.Bircetonitrile to mol için organik bir çözücüyü değiştirmek belirli çiftler için ters çevirebilir.
  • [FONT=0)Retention faktörü (k)): ), organik çözücü kontrollerin genel elution gücü yüzdesini azaltır. daha yüksek organik bir içerik, k'ı tüm analytes için azaltır, kromatogramı sıkıştırır.

Mobil fazın her bileşeninin bu parametreleri nasıl etkilediği konusunda ayrıntılı bir anlayış, analistin tahminlere güvenmek yerine ayrımları sistematik olarak optimize etmesine izin verir.

Mobile Stage'in Anahtarları

Su ve Aqueous Buffers

Su, RP-HPLC. Yüksek hacimli su (Type I, dirençli, ≥ 18.2 M ⁇ cm) temel gürültüden kaçınmak için zorunludur, hayalet zirveleri ve sütun kirliliği.Buffers, pH'yı kontrol etmek için eklenir, UV absorbe, acetate, format ve trifluoroacetik asit (TFA) 10 mM ve 50 mM arasındaki konsantrasyonlarda.

Organik Yemeler

En yaygın üç organik modifier are acetonitrile (ACN), mol (MeOH), ve tetrahidrofan (THF) her biri ayrı özellikleri vardır:

  • [FONT:0]Acetonitrile:[Dönetici: Low vizity, yüksek eluotropik güç, düşük UV kesim (190 nm). Yüksek verimlilik ve hızlı analiz gerektiren ayrılıklar için mükemmel. ACN birçok yöntem için varsayılan seçimdir.
  • [FONT=0)Mol:[Dönetici:[Dönetici:0) ACN'den daha yüksek vizyumlar, bu da baskıyı artırabilir. Farklı seçicilik sağlar, özellikle kutup bileşikleri için.
  • [FONT:0]THF: [DÜDÜDÜDÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜ: 0,0) KAYNA: [DÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜye Olmayanlar, ancak kullanımı yüksek UV absorbesi (cutoff ~212 nm) ve potansiyel istikrar sorunları ile sınırlıdır.

Su, ACN ve MeOH'in Ternary karışımları bazen iyi seçilmişliğe alışkındır, ancak ikili karışımlar sağlamlık için daha yaygındır.

Katkılar ve Ion-Pairing Reagents

Suçlanmış analitler (örneğin, karbokylic asitler, amines, peptidler), sabit iyonizasyon devletlerini sağlamak için mobil aşama pH kontrol edilmelidir. Her zamantafluorobutyric asit (HFBA) veya triethylamonium fosfatu sabit iyonize sinyallerin içine bölünmesi için eklenebilir.

Organik Yeme ve Yüzde Etkisi

Kalçayı ayarlamanın en basit yolu, organik bir çözücünün oranını değiştirmektir.In isokratik elution, run boyunca sürekli bir kompozisyon kullanılır. In gradient elution, organik yüzde zamanla artar, analytes'in geniş bir aralıkta çeşitli hidrofobiklıkları ile ayrılmasına izin verir.

Isocratic Optimizasyon

Belirli bir çözücü için, organik yüzdenin tutulmasını azaltın (yüksek k) ve genel olarak karar verir, bu analiz süresi kabul edilebilir kalır.Bir başparma kuralı: ilk zirvenin k'ı 1 ve 5 arasında olmalıdır ve son zirve 5 ile 20 arasında olacaktır.Eğer k' değerleri çok düşükse, hacmin yakınında toplanır; eğer çok yüksek olursa, analiz süresi aşırı ve zirvede gerçekleşir.

Ancak, artan bir saklama ayrıca, sabit aşamada yavaş toplu transfer nedeniyle zirvenin riskini de artırıyor.En iyi organik yüzde genellikle bir scouting gradient (e.g.,% 95 B over 20 min) çalıştırarak bulunur ve sonra ilgi alanını merkeziler olarak seçer.

Gradient Elution

Gradient yöntemleri, örneklerin geniş bir kutup aralığı ile analitler içerdiğinde önemlidir. gradient eğim (günde %B) önemli ölçüde karar verir. Steeper gradients sabitlenir ancak genel karar azaltır; daha uzun vadede daha düşük derece yüksek çözünürlükte zayıf gradyanlar artış.

Notlar Arasında Seçici Değişiklikler

Acetonitrile'den mol (veya bir karışım kullanarak) geçiş, MeOH'yi bir eşdeğer elution gücü ile yeniden değerlendirme emriyle değiştirebilir (örneğin, ACN, her bileşik için farklı bir şekilde ölçeklendirme işlemine göre daha güçlü bir şekilde etki eder).

pH ve Buffer Seçimi

Güvenilir fonksiyonel gruplar içeren bileşikler (aids, üsler, zwitterions), mobil fazın en belirgin kısmı kritiktir.Bir iyoniz edilebilir bir analyte değişikliklerinin tutulması, pK)

  • [FONT=0)Biz asitler (pK[DÜT:1)[DÜDÜDÜDÜDÜDÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜŞÜŞÜNÜŞÜŞÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜŞÜNÜŞÜŞÜNÜŞÜŞÜŞÜNÜŞÜŞÜNÜŞÜN
  • [FONT=0)Zeng üsleri (pK))[Dönetici:2) 6-10): [DFLT:3) Opposite davranışı: yüksek pH'da nötr, düşük pH'da iyonize edilir, temel bileşikler için, ayrılıklar genellikle düşük pH'da yapılır (örneğin, 2.5-3.5) ana bazlı sütunlarda üst kalıp, silik bazlı sütunlarda üst düzeydeki boşlukları artırmak için.

Yenidenrodite edilebilir bir zaman elde etmek için, mobil aşama pH, hedefin ±0.2 birimleri içinde göz ardı edilmelidir.Seks)a)) = 72), acetate (pK).

pH ve Karar

İki analit farklı pK[DÜT:0)a) değerleri olduğunda, pH'ı değiştirmek, nötr bileşikin saklama değişikliklerinin değiştirilmesi ile önemli ölçüde daha güçlü bir şekilde çözülebilir - örneğin, bir karbokylic asit ve nötr bir bileşik diğerini pH 7'da birlikte alabilir; pH'yı 3'e düşürmek, nötr bileşiklerin saklama değişikliklerinin daha güçlü bir şekilde daha güçlü bir şekilde çözülürken, potansiyel olarak çiftleri çözecektir.

Tür spektrometre algılaması, ammonium acetate veya ammonium formatları gibi uçucu tamponlar gereklidir. Non-volatile buffers (e.g., fosfat) elektrospray iyonizasyon ile uyumlu değildir.

Buffer seçimi ve pH kontrolü için faydalı bir kaynak, HPLC mobil aşama hazırlığına yönelik olarak kullanılmaktadır.).

Ionic Strength ve Ion-Pairing Agents

Ionic gücü mobil aşamadaki toplam iyonların konsantrasyonuna işaret eder. iyonik gücü artırmak (NaCl veya artan tampon konsantrasyon gibi bir tuz ekleyerek) çeşitli şekillerde saklamayı etkileyebilir:

  • Güvenilir analitler için, daha yüksek iyonik güç elektrostatik çekim veya ana olarakte ve ikamet eden silanol grupları arasında sabit fazda sık sık sık üst şekli ve kuyrukları azaltır.
  • Ionic gücü aynı zamanda analitlerin, subtly hidroelektrikfobikliği ve saklama derecesini de etkileyebilir.

Uygulamada, 10 mM ve 50 mM arasındaki tampon konsantrasyonlar tipiktir. Çok az iyonik güç üsler için kötü zirve şekline yol açar; çok fazla pompa ve mühürlere zarar verebilir.

Ion-Pair Chromatography

Oldukça kutup veya standart C18 sütunlarında küçük bir tutma gösteren anesteziler için, iyon-onarım reaktifler eklenir.Bu reaktifler negatif kuyruk ve şarjlı bir kafa grubudur. kuyruk adsorupları sabit bir faza, bir piyon-exchange yüzey oluşturmak.Fort-folefonat.

Ion-on-on-on-onarım yöntemleri dikkatli bir equilibrasyon gerektirir (neden 10-20 sütun hacimleri) ve gradient sonrası tekrar eşitsizliğe yavaş olabilir.

Daha ayrıntılı bilgi için, ion-mate yöntemleri hakkında daha ayrıntılı bir rehberlik için, [FONT=0)Agilent teknik not on ion-mate chromatography).

Ek Modifiers: Sıcaklık, Katkılar

Mobil faz kompozisyonunun katı bir parçası olmasa da, sütun sıcaklığı mobil faz etkileri ile güçlü bir şekilde etkileşime girer. Sıcaklık mobil faz viskobuğunu azaltır, daha düşük baskıyı azaltır ve genellikle tutma süresini azaltır. Sıcaklık ayrıca seçiciliğe, özellikle de farklı entropi katkılarından dolayı tercih edilebilir. Birçok modern yöntem kontrollü sütun fırınıları geri dönüşümlü olarak kullanabilir.

Küçük katkı miktarı da üst şekli artırabilir veya belirli algılama modlarını etkinleştirebilir:

  • [FONT=0)Trifluoroacetic asit (TFA))[0.05–0.1% v/v) peptid ayrılıkları için ortak bir iyon-onluk ajanıdır ve aynı zamanda düşük devrelandırıcı olarak da hareket eder.
  • [FONT:0)Triethylamine (TEA)) düşük konsantrasyonlarda (% 0.1 v/v) maskeleme silanol aktivitesinin temel bileşikler için kuyruk azaltılabilir.
  • [FONT:0]EDTA), bazen belirli metal hassas bileşikler için üst kuyruklara neden olabilecekleri chelate metal iyonlara mobil aşamalara eklenmiştir.

Yöntem Geliştirme Mobil Aşama Optimizasyonları için Stratejiler

Modern yöntem geliştirme genellikle, gözlemlenen bir oturma penceresi olarak C18 sütunu üzerinde yapılandırılan bir C18 sütunu üzerinde, bir isokratik kompozisyon tahmin edilebilir: bir k'ın ilk ilgi zirvesi için yaklaşık 2-5'i seçmesi.

Deneylerin Tasarımı (DoE)

Daha karmaşık ayrılıklar için, DoE yazılımı aynı anda birden fazla değişkeni etkili bir şekilde keşfedebilir (örneğin, %B, pH, sıcaklık, tampon konsantrasyon). Tipik bir yaklaşım, 15-20 ile yüz merkezli bir tasarım veya Box-Behnken tasarımı kullanır. yanıt yüzeyi modeli daha sonra optimal koşulları tahmin eder ve sağlamlığı gösterir.

Farklı Köşeler ve Şerbetler

Eğer karar mobil aşama optimizasyonundan sonra yetersizse, bir sonraki adım farklı bir sütun kimyasını denemektir (örneğin C8, phenyl, kutup-embedded C18) veya farklı organik bir çözücüyü. Ticari yöntem geliştirme kitleri hızlı tarama sağlar.

Sistematik bir yaklaşım, [[0)Waters HPLC yöntemi geliştirme kılavuzunda ([Döneticili gradient gradient-to-isocratic dönüşümü için pratik şablonlar sağlayan) tanımlanmıştır.

Pratikler ve Sorun Giderleme

Dikkatli mobil aşama optimizasyonu ile bile, analistler ortak sorunlarla karşılaşabilir:

  • [FONT:0)Peak kuyruk:[Dönetici:[Dönetici: 0) Çoğu zaman temel bileşiklerle silanol etkileşimlerine neden oldu. tampon konsantrasyon, daha düşük pH (üç veya aşağıda), veya TEA gibi rekabetçi bir temel ekleyin.
  • [FONT:0]Split veya çift zirveler:) Indicates eksik equilibration (özellikle de bir gradient sonra), sütun boşluğu veya örneklemenin mobil aşamadaki kısmi bozulması. Yeterli re-equilibration süresi (5-10 sütun hacimleri sağlayın).
  • [FONT:0)Retention time drag:[Dönemli: 1) Genellikle pH sürüklenme, organik çözücü veya sütun sıcaklık dalgalanmaları nedeniyle, kontraton ısıtıcı kullanın ve buffer tazeliği kontrol edin.
  • [FONT:0) Yüksek geri baskı: [DÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜSÜSÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜSÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜD
  • [FONT:0)Baseline gürültü veya sürüklenme:[Dönetici:0) Genellikle UV-absorbing boşluklardan veya tamponlarda HPLC-grad çözücülerini ve taze tamponları kullanın. Gradient sürüklenebilir.

Bir başka mükemmel sorun kaynağı ise, [[0)Crawford Scientific HPLC sorun giderme rehberi).

Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç

Mobil fazın bileşimi, ters fazlı HPLC'de karar verme için en güçlü araçtır.Bu şekilde organik çözücü tipi ve yüzde, tampon pH ve iyonik gücü, ve seçici olarak katkılarını kullanarak, analistler en zorlu ana olarak parçalı karışımlar için temel ayrımı elde edebilir.

sütun teknolojisindeki ilerlemeler, yazılım kılavuz optimizasyon ve sağlam araçlama her zamankinden daha erişilebilir hale geldi. Ancak temel ilkeler değişmeden kalır: mobil aşama hazırlığına dikkat edin, pH kontrolü ve çözücü kalitesi gün sonra elde etmek için gereklidir.

Yüksek kodlu bir laboratuvarda çalışmak veya yeni bir biyoanalytical yöntem geliştirmek, mobil faz kompozisyonunu anlamak ve kontrol etmek için zaman yatırım yapmak veri kalitesine, yöntem sağlamlığı ve uzun vadeli verimlilik.