Kromatografiye ve Ionizable bileşiklere giriş

Kromatografi, ana olaraklanabilir olan en güçlü analitik tekniklerden biri olarak kalır, tanımlamak ve karmaşık karışımlarda bileşenleri ölçmek. sıvı kromatografide, mobil faz kompozisyonu doğrudan analitlerin tutma davranışını yönetir.Bu makale, pH'nın optimize edilmesi ve kromatografisi için pratik bir ayırma stratejileri sunar.

Ionizable bileşikler ve onların pH-Dependent Davranışları

Asitler, Bases ve Ampholytes

Ionizable bileşikler, protonları ya da kabul edebilecek işlevsel gruplar içerir. Carboxylic asitler (R-COOH), fendi asitler ve sulfonik asitler tipik asit gruplarıdır. Amines (R-NH)[Düzersizler, asitler ve guanidineler temel gruplardır ve birçok farmasötik ve temel moieleler içerir.

P)Ka) ve Henderson-Hasselbalch Equation

PK[DÜ:0)[Dönemli bir grubun yarısının iyonize formda olduğu pH'dır ve yarısı nötr.The Henderson-Hasselbalch denklemi bu dengeyi açıklar:

[FONT=0)=[====)[Dönem:2) + log ([A-)/[HA)[DÜye Olmayanlar için[DÜye Olmayanlar için)[DÜye Olmayanlar İçindeler)

[B]/[BH+)[B][B][B][B]/[BH+)[D)[Dönetici için bir temel için[Dönemli)

Mobil faz pH pK) altında iki birim olduğunda, bir asitin% 99'u, aksi takdirde şarj edilen ve şarjsız devletler arasındaki bu ikili değişim, pH varyasyonu üzerindeki dramatik değişikliklerle gözlemleniyor.

PH, Ters-Phase Chromatography'de Nasıl Etkilenir

Neutral vs. Ionized Tür

Ters-faki chromatography, istasyonsal faz, hidroelektrik (tipik olarak C18). Neutral, sabit olmayan analytes bölmesi sabit bir şekilde istasyoner aşamasında, pH 4'te tamamen nötr olan bir bileşik daha kutup ve hidrophilic; mobil fazı tercih eder ve daha önce de elute.Bu nedenle, analytenin iyonizable olduğunda, pH 4'da tamamen nötr olan bir bileşik, pH 7'da tamamen nötr olabilir ve bir kılabilir.

Seçici Manipulation

pH'ı ayarlayarak, analistler belirli bir analytes'i bir karışım içinde seçici olarak geliştirebiliyor veya bastırabilir.Bir asit içeren bir örnek (pK) ve bir baz (pK) ve baz (pK) ilerleyicidir. pH 3, asit nötr (retained) ve temel tamamen protonlu (polar, daha az muhafaza edilir).

Peak Shape ve Tailing

Ionizable bileşikler genellikle mobil faz pH'ı optimize etmediğinde zayıf zirve şekilleri üretir.Partly ionized anestezik, chromatografik zaman ölçeğinde yavaş yavaş yavaş yavaş yavaş yavaş yavaş yavaş yavaş yavaş, geniş, kuyruk topları için çalışır.Buffered mobil aşamalar en azından iki ila iki adet pK)) Bu yüksek bozulmaya neden olan iki formdadır.

Buffer Selection ve pH Stability

LC için Common Buffers

İstenen pH aralığında yeterli kapasiteye sahip bir tampon seçmek önemlidir. Phosphate buffers pH 2-3 ve 6-8 için yaygın olarak kullanılır, ancak yüksek çözünürlükte ve sıra dışı asit (pH 3–4) ve acetate (pH 4–5) tamponlar uçucu ve MS dostudur.

Achieving Reproducality

Buffer konsantrasyonu en az 10-50 mM'nin tutarlı iyonik güç ve pH kontrolü sağlaması gerekir. Bir tampon ile bile, sıcaklık dalgalanmaları pH'ı değiştirebilir (tipik olarak -0.01 ila - 0.00.03 pH birimleri °C) ±0.5°C'de sıcaklık korumak için bir sütunu kullanın. Ayrıca, degas, pH'yı zamanla azaltır.

Mobile Phase pH vs. Aqueous pH

Organik modifiers (örneğin, acetonitrile, mol) eklendiğinde, hidro-organik karışımdaki etkili pH, aköz tampon pH'dan farklı olabilir. Mobil fazın pH'ı karıştırdıktan sonra ölçülmelidir, veya en azından tampon pH'nın termosiyel etki için ayarlanması gerekir.

Pratik Yöntem Geliştirme Stratejileri

Börek pH Gradients

Yöntem geliştirme için ortak bir yaklaşım, KuruLab veya ChromSword gibi bir pH makasını çalıştırmaktır: pH'da pK, 4.0, 6.0, 8.0 ve 9.5'te herhangi bir pH kullanımı ile örnekleme işlemine enjekte edilebilir.

pK[DÜ:0)[DÜDÜT:0)[DÜT:0)

Deney pK)a[D)[D/Labs veya MarvinSketch gibi yazılımlar ile ilgili olarak, makul bir doğrulukla (±0.5 ünite) hesaplanan bu araçlar (örneğin, en güçlü tahmin edilen pK[FLT) veya iki birim ile başlayan bir pH ile başlar.

Vaka Çalışması: Weak Asits ve Bases'in bir Mixtureunu Keşfedin

Zayıf bir asit içeren bir karışım düşünün (pK[DÜDÜT:0)a[DÜDÜT:1) ve zayıf bir temel (pK)) sönüllü (ortalama) ve temel nötr (taraflı) olarak muhafaza edilir; temel tamamen protonlu ve elutes erken. 5.5'de, her iki bileşik kısmen iyonize edilir ve pH 8.0'da asit tamamen iyonize edilir (ortalama).

Tersane-Phase'in Ötesinde: HILIC ve Ion-Exchange

Hidrofilik Etkileşimli Sıvı Kromatografi (HILIC)

HILIC'de, sabit faz kutuptur (örneğin, silik, amid, zwitteronik) ve tutma suyu zengin bir tabakaya bölmek için yönlendirilir. Ionizable bileşikler ters tutma davranışı tersine getirir: HILIC'de daha fazla şarj edilen türler daha fazla hidrofilik olur ve kutup istasyonu fazına güçlü bir şekilde etkilenirler.

IonExchange Chromatography

ionexchange chromatography, pH hem istasyonsal fazda hem de ana olarakta. Güçlü bir cation (SCX) için, sabit faz her zaman negatif olarak şarj edilir; pH sabit bir şekilde şarj edilebilir ve saklama için doğru bir şekilde ayarlanır.[TFL)[TFL:0[TFL)[TFL:0)

Sıcaklık, Ionic Strength ve Note Effects

Sıcaklık Bağımlılığı

Sıcaklık sadece viskobu ve diffüzyonu değiştirmez, ancak aynı zamanda pK)a) değerleri (tipik olarak -0.02 - 0.04 pK)a) çoğu asit ve üsler için °C değiştirir ve akış şeklini hızlandırabilir.

Ionic Strength

Buffer tuzların konsantrasyonu (iyonel güç), temel bileşikler için kuyrukları etkiler, böylece etkili pK)a) özellikle yüksek organik içerik ile, tipik bir başlangıç noktası 20 mM tamponad ile elektrostatik etkileşimlerin ekranını etkileyebilir.

Organik Modifier Etkisi

Acetonitrile ve mol, belirgin pK)[Döneticileri değiştirerek, dielektrik sabit ve çözünürlükte daraltın. Genel olarak, organik çözücüler ekinleri ekleyin.)a) asitlerin ve pK)) bazı temellerin altında, pH aralığının ne kadar nötralize olduğunu anlamak için özellikle önemlidir.

Gelişmiş Konular: Co-Ion Effects ve Karma-Mode Fazlar

Co-Ion ve Counter-Ion Effects

In ionmate chromatography, bir karşıtlık (örneğin, TFA, her zamantafluorobutyric asit veya triethyla) şarj edilebilir (TFA -) ve çiftleri şarjlı üslerle oluşturabilir. pH 7'de, TFA hala nötr olabilir, pH'yı azaltır ve ion iki katına çıkarır.

Karma-Mode İstasyonuary Phases

Karmaşa sütunları, ion-exchange işlevi ile tersane bir araya getirir (örneğin, C18 + zayıf anion değişimi). Bu aşamalar yüksek kutuplu seçiciliği sunar ve pH ile uyumlu bileşikler olabilir.

Pitfalls ve Sorun Gider

Irreproducible Retention

Uzaklaşmalar arasında zaman tutun, şüpheli pH istikrarsızlık.Bufferin taze olduğunu kontrol edin, pH elektrot kalibre edilir ve mobil aşama doğru şekilde hazırlanır. Ayrıca sütunun tamamen equilibrated (10-20 sütun hacimleri) doğru bir şekilde doğru şekilde işlenmesini kontrol edin.Temel bileşiklerle Silanol etkileşimleri sütun olarak kademeli olarak tutma değişikliklerine neden olabilir; düşük yaşlardan kaçınmak için özel bir alçak köşeyi kullanmayı düşünün.

Peak Splitting veya Omuzlama

Bir zirve bölünmüş veya bir omuza sahipse, mobil aşama pH muhtemelen pK))[Dönetici) ısıyı artırmak, ancak bir pH değişikliği genellikle iki form arasındaki yavaş iç içelemeye neden olur.

Buffer Precipitation

Phosphate buffers yüksek konsantrasyonlarda organik çözücü ile önceden bilgi sahibi olabilir. Her zaman kullanımın son oranına tampon ve organik karıştırın ve aşırı yüksek tuzlu konsantrasyonlardan kaçının (≥100 mM) uçucu tamponları kullanarak (formate, acetate) bu riski azaltır.

Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç

Mobil fazın pHı, tersanede yüksek değişkendir ve pH etkilerinin katı bir şekilde anlaşılması gerekir[Dönemli)[Döneticiler, yüksek çözünürlükte, yüksek çözünürlükte, yüksek çözünürlükte, doğrulanmış sistemlerle birlikte, doğrulanabilirler.[Dönemli)