Modern genetik araştırma, hassas gen-editing aletlerinin geliştirilmesi tarafından yönlendirilen bir döneme girdi. öncü teknolojiler arasında TALENs (Transcription Activator-Like Influenceor Nucleases) ve ZFNs (Zinc Finger Nucleases) CRISPR devriminden önce DNA'yı hedef alan temel platformlara girdiler. Bu mühendisler, bilim insanlarının tanımlanmış genomik yerlerde çift-parçalı rotaları tanıtmasına veya genetik olarak genişletmelerine izin verdi.

TALENs ve ZFNs'in Mechanismlerini Anlayın

Çinko Parmak Nucleases: modüler DNA Tanıklığı

ZFNs, ilk olarak programlanabilir nükleazlar olarak kabul edilen ilk kişiydi, ilk olarak orta 1990'larda açıklanan.Her ZFN, çinko parmak proteinlerinden bir DNA-binding alanı ve 9 ila 18 baz çiftlerinden elde edilen DNA-cleavage domaini bir araya getiriyor.)FokI kısıtlaması).

Mekanik parmak dizilerinin tasarımı ve montajı, bağlantıya bağlı varlıklar nedeniyle teknik olarak zorlanabilir - çinko parmağının tanınması, pregenik hayvan modellerini ortaya çıkarabilir ve erken klinik çalışmalarda mutasyonlara neden olabilir.

Transcription Activator-Like Influenceor Nucleases: Single-Nucleotide specificity

TALENs, 2009–2010 yılları arasında daha basit tasarım kuralları ile alternatif olarak ortaya çıktı. DNA-binding domaini transkripsiyonatif amino asit kalıntılarından (TALEs), proteinler bitki patojenürü tarafından gizlilendi (RVanthomonas[FLT)[D-nüklezonlar[Döneticileri 1 ), her bir nükleotid, bu iki hipervariable amino asit kalıntıları tarafından belirlenen, bu iki hipervarians için HD (RVD-nükleotid)

TALENs ayrıca, Altın Kapı klonlama veya katı-faz sentezini kullanarak elde edilebilir. TALENs genellikle ZFNs ve daha düşük toksisite hücrelerinden daha yüksek spesifikiteyi sergileyebilir, ancak büyük boyutları (~3 kb) viral vektör teslim için bir sınırlama olabilir. Bununla birlikte, yine de, Zebrafish, sıçan, domuz ve insan hücresinde başarılı bir şekilde uygulanabilir.

Tarihsel Gelişim ve Milestones

Mühendisli nükleazların yolculuğu, 1980'lerin sonlarında çinko parmağı proteinlerinin keşfiyle başladı. 1996 yılında, Chandrasegara ve meslektaşları üç tane enzinc-finger domain toİLFLT:0)FokI) tarafından, bu atılım, ZFN'de yapılan ilk ZFN'yi gerçekleştirmeye yardımcı oldu:2Drosofili ve daha sonra insan hücrelerindeki deneyleri ve daha sonra.

TALEN teknolojisi, 2007 yılında TALE proteinlerinin yapısal olarak incelenmesinden sonra hızla gelişmiştir. Üç yıl içinde, çeşitli gruplar maya, bitkiler ve insan hücreleri için genetik olarak tasarlanmış domuzlar bildirdi.Kim ve Kim (2014) tarafından genom düzenlemesini kabul etti, genetik bir dalgalar yaratarak [Dönem:2]

Modern Araştırma Uygulamaları

Tıbbi Araştırma ve Gen Terapisi

ZFNs ve TALENs, monojeneratif bozukluklar için gelişmiş gen terapisine sahiptir. hasta hücre hastalığı ve beta-thalassemi, ZFNs hedeflemekte:0)Bur11A) erythroid, nükleerede fetal hemoglobin ifadesiyle reaksiyona girer.[Dördüncü PPV) ZFNs ile kombine edilen mutasyonlar kullanılarak kombine edilir.

Tarım Biyoteknoloji

Ek olarak, TALENs ve ZFNs, 2019 yılında Calyxt tarafından geliştirilmiş ve üretilen TALENSİMELER ve SanderOURD'ler, bu nükleazların ilk pazarı, gelişmiş petrol profili ile adayan, bu daimsiz genetik değişikliklerle gelişmiştir.

Fonksiyonel Genomlar ve Model Organizmleri

Her iki platform da embriyonik kök hücrelerinin kullanılamadığı türler için sistematik gen nakavt çalışmaları etkinleştirdi. zebrafish, TALENs, tek bir konsorsiyum çabasında, gen fonksiyonlarını geliştirme ve hastalıkta ortaya çıkarmak için >200 hedeflenmiş bir yöntem oluşturmak için kullanılmıştır.In sıçanlarda ZFNs, nörodejeneratif ve kardiyovasküler hastalıklar için enfekte modellerin yeniden tanımlanmasını sağladı.

Güçlüler ve Sınırlar CRISPRCas9 ile karşılaştırıldı

CRISPR-Cas9 (2012)'in ortaya çıkışı, RNA'nın düşük maliyetli ve daha yüksek verimlilik, yaygın olarak kabul edilmeye yol açtı. Ancak, TALENs ve ZFNs benzersiz avantajları koruyor. Protein bazlı DNA tanımaları, RNA'nın aracılı hedefli bir virüse güvenmiyor, otomatik olarak kapatılabilir. Ayrıca ZFNs ve TALENs ve TALENs, tekrarlayan veya GC zengin bölgeleri için daha yüksek bir zorluk sergilemektedir.

Önemli bir sınırlama, yeni ZFN veya TALEN'leri her hedef için mühendisine ihtiyaç duyulan maliyet ve iştir.CEDNT sadece 20-bp kılavuzunu yeniden tasarlarken, ZFN ve TALEN sentezü protein domain assembly ve geçerliliğini talep eder.Uygunluk dışı bir endişedir; çinko parmak dizileri yanlış eşleştirmelere katlayabilir ve TALENDFLD'nin üç boyutlu yazıcıdaki karşılaştırmalara katılabilir.

Future rota ve devam eden iyileştirmeler

Mevcut araştırma, TALEN'lerin ve ZFN'lerin verimliliğini ve güvenliğini artırmayı amaçlamaktadır ve üretim maliyetlerini azaltırken ZFN'ler gelişmiş termostability ve cytotoxicity. Structure-guided redesign of TechT) varyantlar ( ELDKKKRKR ve Sharkey gibi) gelişmiş termostability ve katalitik aktivite ile elde ettiler. TALENler için, makine-öğrenme algoritmaları için şimdi en iyi RVD kombinasyonlarını tahmin edinirler ve altın kapı klonlamalar tek bir günde bir dizi üretim sağlar.

Teslimat, in vivo uygulamalar için bir şişenck kalır. Lipid nanopartiküller ve adeno-associated viral vektörler, hematopoitik kök hücreleri ve her zamansitleri geliştirmek için geliştirilmektedir.Tampiyonel zeminler (DNA’dan daha önce) bu önceden belirlenmiş güvenlik kayıtları ve piyasa onayı nedeniyle kullanılabilir.

Son olarak, TALEN veya ZFN'lerin temel düzenleme veya asal düzenleme ile kombinasyonu - çift-çevre molalarına güvenen teknolojiler - faydalarını genişletmiş. Örneğin, Zn-finger-linked cytidine deaminase, çift-parma olmadan yeni İngiltere'yi hedef alan dönüşüm gerçekleştirebilir. [FONT:0]) ZFN bazlı olarak yayınlanan klinik denemeler [CCR5).

Sonuç olarak, TALENs ve ZFNs genetik araştırma aracı kutusunda hayati öneme sahiptir. Farklı özellikleri - insan sağlığını ve gıda güvenliğini geliştiren keşifleri katleyeecektir - özellikle RNA bazlı araçlar uygun olmayan olduğunda, bu öncü nükleasesler insan sağlığını ve gıda güvenliğini geliştiren keşiflere devam edecektir.