Neural kök hücreleri (NSC) kendini yeniliyor, gelişimsel biyoloji için vazgeçilmez araçlar yapıyor ve proliferatif tıbbın temel özelliklerini koruyor: nöronlar, genetik ve genetik istikrarı korumak için en iyi şekilde tasarlanmış ve besleyici parametrelerin optimizasyonunu gerektiriyor.En iyi koşullardan küçük sapmalar bile, gelişimsel biyoloji, hastalık modelleme, ilaç taraması ve rejeneratif tıbbın kaybı.

Neural Stem Hücre Biyolojisini ve Kaynakları Anlamak

NSCs embriyonik, fetal veya yetişkin sinir dokularından izole edilebilir.Indüktör NSCs, telense veya omurdan elde edilen en yüksek proliferatif potansiyeli sergileyebilir, yetişkin NSCs, subventricular bölgesinden veya hippocampus'tan daha sınırlı bir büyüme gösterirken, Indüklenen pluripotent kök hücre (iPSC)-derived NSC'ler ölçeklenebilir, hastaya özel bir alternatif sunar.

NSC'lerin karakterlendirilmesi için anahtar işaretler Nestin, Sox2 ve Pax6'yı nöro öncüler için ve GFAP'ı yetişkindeki radial glia benzeri hücreler için. Başarılı bir kültür, bu işaretlerin en az ifadesiyle, TUJ1 (neurons) veya O4 (oligodendrositler) olarak korur.

Temel Çevre Parametreleri

Sıcaklık ve pH Stability

NSCs genellikle CO2 ile% 5 CO2 ile birlikte ortalama 37°C'de kültüre sahiptir. CO2 seviyesi, 7.2-7.4'te bir pH artışı sağlamak için ortadaki biyokarbonat tampon sistemi ile çalışır.

Oksijen Gerr

Standart incubatörler atmosferik oksijende çalışır ( ⁇ 20% O2), ancak gelişmekte olan ve yetişkin beyin aralıklarında% 1 ila% 5 arasında fizyolojik oksijen seviyelerinin düşük oksijenli ortamlara kadar (N-5% O2), oksidatif stresi artırmak ve çokpotency’in zarar vermesine neden olmuştur.

Nem ve Gaz Değişimi

Yüksek nem (≥95) kültür ortamının tahliyesini engeller, aksi takdirde gazın büyümesini ve ısıtıcıların su seviyesini izlemek ve steril su ile değiştirilmesini tamamen önemlidir; önlenebilir kapaklar veya filmler kullanmadan, dışlanmadan kaçınmak.

Media Piano ve Formulations

Bazal orta ve derin etkiler NSC davranışları. En yaygın formülasyonlar Nörobasal orta ( birincil nöronlar için gelişmiş) ve DMEM /F12 (Dulbecco'nun Modified Eagle Medium ve Ham's F12). Ancak, NSCs benzersiz metabolik ihtiyaçlarını desteklemek için özel katkı gerektirir.

Basal Media

  • [FONT:0]Neurobasal Medium) - Mikrobiyomlar için tasarlanmış B27 takviyelerinin daha düşük seviyeleri ve B27 takviyelerinin mikro kültürler için tasarlanmıştır.
  • [FONT=0]DMEM/F12[[DÜT:1) - Emrah ve iPSC-derived NSC kültürler için yaygın olarak kullanılan ve tek katmanlı kültürler için birçok protokoller, temel olarak DMEM/F12'yi destekler.
  • [FONT=0]Müşteri Formulaleri[[[Döneticiler)[[[Döneticiler)[değiştir | kaynağı değiştir] – Bazı laboratuvarlar, tam olarak insülin, transferrin, selenium ve progesterone (e.g., N2 veya B27) ile tanımlanır.

Büyüme Faktörleri

NSC kültürü için iki kritik miogens epidermal büyüme faktörü (EGF) ve temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF veya FGF-2) genellikle 10-20 ng /mL'ye ek olarak, hücre döngüsünü teşvik eden ve apoptozların tek bir faktör kullanmasına yardımcı oluyor, ancak bir kombinasyon genellikle daha yüksek genişleme oranları sağlar.

Serum ve Supplements

Fetal bovine serum (FBS) şu anda tavsiye edilmez:0) Farklı olmayan NSC'leri korumak için çünkü farklı olmayan faktörleri içerir.

  • [FONT:0)B27 Supplement[[DÜDÜT:1) - Contains antioksidan (katalase, süperoksit dismutase), şişman asitler ve hormonlar başlangıçta nöronal hayatta kalmak için gelişmiştir, ancak büyüme faktörleri ile birlikte NSC genişleme için iyi çalışır.
  • [FONT:0]N2 Supplement[DÜDÜT:1) - Contains insülin, transferrin, progesterone, putrescine ve seleni.B27'den daha az karmaşıktır ve genellikle DMEM/F12 ile nörosphere kültürü için kullanılır.
  • [FONT=0)GlutaMAX ) veya [[Döntamine[DÜ:3) - Glutamine hücre metabolizması için gereklidir, ancak zamanla bozulabilir; GlutaMAX daha istikrarlı dipeptid formu sağlar.

Antibiyotikler ve Antimycotics

Routine penicillin-streptmisin (100 U/mL) kullanımı yaygındır, ancak uzun maruz kalma, hücre davranışını etkileyebilir ve hücre davranışını etkileyebilir. kritik deneyler için, antibiyotiksiz kültürleri titiz asptik teknikle düşünün.Eğer fungal kontrasepiyonel B veya mantar bölgesi eklenirse, amphotericin B veya mantarlar da NSC'lere yüksek konsantrasyonlarda toksik olabilir.

Substrate ve Surface Optimizasyon

İki-Dimensional Monokat Kültürü

Engel NSC kültürleri için, yüzey hücre ekliğini ve hayatta kalmalarını sağlamak için kaplı olmalıdır. Altın standart, elektrostatik bağlayıcı için olumlu bir kaplamadır:0) Eşleştirme ve çoğalmaya yardımcı olan L-L-ornithine (PLO) suda (günde) ve lamda)

Kaplamalar fibronectin veya Matrigel ile değiştirilebilir, ancak bu tanımlanmamış bileşenler. Yüksek kodlama için sentetik peptid-coated yüzeyler (e.g., RGD veya IMATV motifleri ile) geliştirilmektedir.

Üç Boyutlu Nörosiyal Kültür Kültürü

Nörospheres, bir substrat gerektirmez NSC'lerin serbest toplayıcı agresyonudur. Bu sistem köklüğü ve pıhtılaşmayı korumak için yararlıdır. Ancak, nörospheres nekrotik merkezleri geliştirirse çok büyük büyür (>200 μm).Bu, dissociate küreleri her 5–7 gün boyunca enzymatik yöntemleri (Accutase veya dene-EDTA) ve nazik mekanik triturasyonlar, Sphere'leri 200 μm'yi daha fazla koruyabilmeleri için geçiş yapmalıdır.

Sörfler ve Hidrogels

Doku mühendisliği uygulamaları için, NSCs genellikle biyomimetici scaffolds'ta gömülüdür ve NSC kültürü genellikle 0.1-1 klümlü asit hidrojektestesi olarak görülür.Bu 3D ortamlar daha iyi recapitulate matrisi teşvik eder ve sertlik için ayarlanabilir ve korelasyon için en iyi sertliktir.

Stemness'i korumak ve Spontaneous Farklılaştırmayı Önlemek

Geçme Stratejik

NSCs 70-80 konfluence (monokat) veya nörospheres 150-200 μm'ye ulaştığında, hücreler bağlantıya dönüştürülür ve hücreli viability için azaltır. nazik bir dissocitasyon yöntemi kullanın: Accutase, prodüktörleri denemekten daha hafiftir.

Farklılaştırmanın Adları

Birkaç küçük molekül, büyüme faktörlerinin yanı sıra kullanılan öncü bir durumu korumak için yardımcı olabilir:

  • [FONT:0)Rho-associated kinase (ROCK) inhibitör Y-27632[Dönetici:0)[0) Rho-associated kinase (ROCK) inhibitör Y-27632[[DÜT:1) (10 μM): Ayrı hücrelerin hayatta kalması ve anoikis azaltır.
  • [FONT=0]MAD sinyal vericiler [Dönetici: · 1 ) (e.g., SB431542, LDN-193189): IPSC sinir indüksiyonunda ilk olarak kullanılmış ancak bazı NSC hatlarına eklenebilir.
  • [FONT=0)GSK-3 inhibitörleri [Dönetici: Activate Wnt sinyalleme, bazı NSC alt tiplerinde çoğalmayı teşvik edebilir, ancak dikkatli titrasyon, lineage önyargıdan kaçınmak için gereklidir.

Bir Stemness Faktörü Olarak Hipoxia

Daha önce de belirtildiği gibi, düşük oksijen basıncı (2-5% O2), DNA hasarına ve senatoya neden olabilir (HIF-1α ve HIF-2α) gibi köksel genleri kullanarak, Sox2 ve Notch1 gibi düşünün. Hipoxia da reaktif oksijen türlerini azaltır (ROS), aksi takdirde, DNA hasarına ve senatoya neden olabilir.

Kalite Kontrol ve Karakterizasyon

NSC kültürlerinin düzenli izleme tutarlılık ve yenidenrodite edilebilirliği sağlar. Temel kalite kontrol önlemleri şunları içerir:

  • [FONT=0]Morphological inceleme:[Dönetici:[Döncükler) Monokatli iki veya çok fazla morpolar morsoloji ile faz-bright hücre bedenleri ile yuvarlak olmalıdır. Granular görünüm veya yarı-parçacıklar farklı şekillerde ortaya çıkar.
  • [FONT:0)Immunocytokimya: [Dönetici: 0 [Döneticisel fikre karşı) Stain for Nestin (immature sinir öncü), Sox2 (pluripotency/neural köklüğü) ve Ki-67 (proliferasyon) Low geçiş kültürleri,% 90 Nestin-pozitif hücrelere sahip olmalıdır.
  • [FONT=0)Flow cytometri: [Dönder:[Dönder:[Dönder:0)) CD133 (prominin-1) ve CD15 (SSEA-1) gibi yüzey işaretleyicileri.
  • [FONT:0)Karyotyping: [Dönetici:[Dönetici: [Düzg: Her 10 pasaj), kendiliğinden ortaya çıkabilecek kromozomal anormallikleri tespit etmek için.
  • [FONT:0]Mycoplasma testi:[Dönetici: 1) PCR tabanlı kitleri her ay kullanır. Mycoplasma enfeksiyonu ciddi şekilde hücre davranışını değiştirir ve istenmeyen gidebilir.

Sorun Ortak Konuları Sorun Gidermek

Zavallı Hücre Atament

Hücreler 24 saat içinde kapanıyorsa, düzelme kalitesi sağlayın. PLO ve laminin çözümleri taze ve sterildir. kaplama çözümünin pH'ının uygun olduğunu kontrol edin (minin pH 7.2-7.4) Daha tutarlı sonuçlar vermeye eğilimli olan rekombinant laminin kullanılması gerekir.

Low Proliferasyon

Yavaş büyüme, bitki büyüme faktörlerinden sonuçlanabilir - her 2-3 gün boyunca taze EGF/bFGF'i ekleyebilir. Hücreler düşük oksijene uygulanırsa, standart koşullara transfer etmek, büyüme oranını yavaş yavaş yavaş artırabilir, ancak temasını artıran yüksek yoğunluktan kaçınır.

Spontaneous differentiation

Farklılaştırma genellikle uzun, dallı süreçler veya hücreli kabuklar düzleştirilmiş hücrelerle görünür. daha önce geçiş yaparak etkilenebilir. Herhangi bir serum veya keşfedilmemiş takviyesi alın.Eğer nörospheres kullanıyorsanız, onları çok büyük büyütmelerine izin vermek. Bazı NSC hatları, köklüğü korumak için ek gerektirir; bir Notch aktiveatörü eklemeyi düşünün.

Contamination

Bakteri veya fungal kontraseptür genellikle açıktır (bulut orta, pH damlasını önlemek için).Her zaman 0.22 μm filtreleri aracılığıyla filtre büyüme faktörleri, steril teknikleri kullanın ve incubatorunu izole edin.Inst konfeksiyon için, antibiyotiksiz ortamda birkaç pasaj daha sonra temiz hatları sağlamak için antibiyotiksiz ortamda.

Farklılaştırma protokolleri (Brief Genel Bakış)

Bu makalenin odağı, distal olmayan NSC'leri korumak için değerli olsa da, beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDD, 10 ng / FF) ve glitrofik faktör (GDNF) gibi nörotrosit yüzeylere (GÖRT) uygun olmayan bir şekilde eklenebilir.

Future Perspectives ve Uygulamaları

Kültür optimizasyonundaki ilerlemeler, oksijen ve bezlenebilir ve fizyolojik olarak ilgili NSC modellerini mümkün kılar. Kimyasal olarak tanımlanmış, xeno-free medya kullanımı toplu etkileri azaltır ve klinik çevirileri destekler. Microfluidic platformları şimdi, oksijen ve bezlerin dinamik kontrolünü sağlar, sinirsel olarak NSC’leri taklit eder.

Ayrıca, mikrokarrierlilerle karıştırılmış biyoreactors'lar endüstriyel uygulamalar için geliştirilmiştir. Bu sistemler, hear stres ve gaz transferinin dikkatli bir şekilde izlenmesini gerektirir, ancak nakil çalışmaları için milyarlarca NSC üretebilir. FDA'nın rehberliği, sağlam kaliteli özellikler için gerekli vurgular, optimize edilmiş kültür koşullarını düzenleyici bir ön koşulu haline getirir.

Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç

Sinir kök hücreleri için kültür koşullarını optimize etmek, NSC'nin kendini yenileyen, genomik istikrar ve farklılaştırmayı gerektiren çok yönlü bir görevdir.Normal karakterizasyon ve büyüme faktörlerinden oksijen gerilim ve substratı sertlik kontrolüne kadar daha fazla sorun gidermeyi sağlamak.Bu optimizasyon stratejileri gelişmekte olan beyin atılımlarını devam edecek, nörobilim ve rejeneratif olarak koruyabilir.