Uzun süreli Sequencing for Kompleksi Genomu için Gelişen Teknikler

Uzun süreli sequencing teknolojileri, daha önce kısa süreli yöntemlerle karmaşık genomların sorgulanmasına olanak sağlayarak temel olarak genomikleri dönüştürdü. Sürekli DNA parçalarını okuyarak, on binlerce temel çiftleri uzun süre boyunca, bu teknikler, bu tekniklerin büyük yapısal varyantları çözmesine olanak sağlıyor ve faz haplotipleri uzun süreli tekniklere göre en son gelişmelerle inceler.

Uzun zamandır Son Gelişmeler Sequencing Platforms

Son birkaç yıl kimyada olağanüstü ilerlemeye tanık oldu, donanım ve yazılım uzun süreli (SMRT) Pasifik Biyobilimleri (PacBio) tarafından düzenli olarak 15 kilobases'i okumanın önemli ölçüde arttığını ve Oxford Nanopore Teknolojileri (ONT) son zamanlardan beri tek bir mikroplaklı gerçek zamanlı olarak ortaya çıktığını gösterdi.

Kütüphane hazırlığı protokollerinde gelişmişlikler veri kalitesine daha fazla katkıda bulunur. DNA hasarını en aza indirmek, parçalamayı azaltmak ve moleküler yüklemeyi optimize etmek için uzun süreli hataların süresini artırmak için gösterilmiştir.For PacBio, ham long reading to <0.1%, reading that are both long and correct.

Hesaplama tarafında, temel arama algoritmaları basit gizli Markov modellerinden derin bir şekilde evrimleşmiştir ve doğrudan çiğ sinyalden değiştirilmiş üsler (örneğin Guppy, Bonito ve son zamanlarda yayınlanan Dorado). Bu modeller, düşük kaliteli hataların tespit edilmesi için eğitilmiştir, homopolimer uzunluktaki hataları tahmin etmek ve aynı zamanda çiğ sinyalden değiştirilmiş üsler aramak için.

Key Technologies Sürüş Innovation

PacBio HiFi Sequencing

PacBio'nun HiFi ayrılıkçılığı, Sequel IIe ve Revio sistemlerinde teslim edilen ticari bir anlayış, uzun süreli doğrulukta bir paradigma değişikliği temsil ediyor. Her DNA molekülünü ve birden fazla kez (tipik olarak 15-30 geçiş) bölerek, teknoloji, tekrarlayan bölgelerde% 99.9 doğrulukla karşılaştırıldığında, 50 ila 25 kilobase'den fazla sayıdaki uzun süre boyunca tekrarlamalar üretebilecek olan çok sayıdaki değişiklikleri tekrarlıyor.

PacBio'nun kimyasındaki son yenilikler - Revio sistemi üzerinde daha iyi bir şekilde tanıtıldı ve hücre başına 130 gigabas üretebilen yeni bir SMRT Hücresi kullanıyor ve tüm insanlık dışı kriminaller için gürültüyü azaltıyor - her iki akışta daha fazla baskı koydu. Bu, nüfus ve kaliteye sahip bir SMRT Hücresi ile birlikte, yüksek kalitede verileri hücre başına 130 gigabas üretebilen yeni bir mikrobiyallik çalışmasına kapı açtı.

Oxford Nanopore Teknolojileri

Oxford Nanopore'nin platformları (MinION, GridION, PromethION) farklı bir şekilde tamamlayıcı bir yaklaşım sunuyor: gerçek zamanlı olarak, DNA veya RNA molekülleri, protein nanopore ile geçişleri gibi sıra dışı. Teknolojinin salonmarkı, ultra uzun süreli yaklaşımlar üretebilme yeteneğidir, bazı deneyler 2 milyondan fazla temel çiftleri ile.Bu okumalar, yüksek tekrarlayan bölgelerin yayılması gibi, sentler ve ribosomal DNA dizileri gibi son derece tekrarlayan bölgelerin yanı sıra, son derece karmaşık yaklaşımlar için tasarlanmıştır.

Nanopore sequencing, Dorado yazılımındaki hızlı gelişmeler gördü, rutin olarak 99.5% (Q20+) orta okuma uzunluklarında daha iyi bir genetik cihazda kullanılabilecek en son R10.4.1 gözenekler, Dorado yazılımındaki yüksek arama modelleriyle birlikte, rutin olarak medyan okuttuğunu - aynı zamanda, daha fazla örnek okumadan sonra da nano-parçakal analiz için en iyi analiz etme yeteneği.

Nanopore teknolojisindeki ileri teknikler, gerçek zamanlı hedef seçimine izin veren “Okuma” yaklaşımlarını içerir ve klinik ve alan temelli uygulamalar için erişilebilir olan sequencing runları büyük ölçüde azaltılabilir.

Gelişen Teknikler ve Future Yollar

Hibrit Assembly Yaklaşımları

Her iki PacBio HiFi ve ONT okuması bağımsız olarak yüksek kaliteli meclisler üretebiliyor olsa da, birçok araştırmacı hem platformların en iyilerini birleştiren hibrit stratejileri kabul ediyor.En yaygın yaklaşım HiFiETHT:2.canu[DFLT:3) daha önce, düşük kaliteli formlar ve doldurmalar için, daha önce de düşük çözünürlükte olan bu insansızlığı ile birlikte çalışır.

C ⁇ Algoritmalar için Hata Düzeltme ve Assembly

Uzun süreli hata profilleri temel olarak kısa okumalardan farklı olarak, özel algoritmaların gerekli olduğunu gösterir. Yeni hata düzeltme araçları, örneğin,FLT:0) [FONT için (ONT için) ve )) ve [[Döneticileri [Döneticileri [Dönderilmiş bir grafik için) ile birlikte, yüksek kaliteli bölgelerin tamamının tamamının geliştirilmesi için geliştirilmiş olan ayrıntılı yaklaşımlara göre daha fazla şekilde tasarlanmıştır.

Montaj ötesinde, yapısal varyantları tespit etmek için bilgisayar hatları (SV) uzun süreli okurlar.Aptallar gibi çağrıcılar[Dönderler, · 1 ), [[Dönderler, transkriptler ve mobil hassasiyetler [Dönderler) ile ilgili olarak, bu araçlar, SVs >50 b-p, sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık sık kullanılan okumalar, geri dönüşler için, geri dönüşler için kullanılan bir şekilde, geri dönüşler için, geri

Epigenomic Analysis ile entegrasyon

En heyecan verici gelişen tekniklerin biri, tek kodlu bir şekilde genom dizi ve epigenome'nin tek kullanımlık algılaması ile olgunlaşmıştır.Bu entegrasyon, hammaddesel dönüşümler ve enfeksiyonel tilasyon seviyesi tahminlerinin tek başına kanıtlandığında, ham sinyaldeki değişiklikleri doğrudan tespit ederken, biyosulfite dönüşümü ile birleştirilebilen veya enfeksiyonel tilasyona karşı hassas yaklaşımlarla tekrarlanabilir yaklaşımlarla birleştirilebilen bir noktaya kadar uzanır.Bu entegrasyon kanserli genetik olarak kanıtlanır.

Doğrudan RNA Sequencing ve Transcriptomics

Oxford Nanopore ayrıca, transkript (DRS) doğrudan RNA sequencing (DRS), bu dizinler, RNA'ya karşı transkriptsiz, daha iyi bir şekilde duyarlılık ve özellikle RNA modifikasyon algılaması için eğitilmiş modeller için eğitilmiştir. Doğrudan RNA sequencing yeni pencerelere alternatif olarak yeni pencereler açıyor.

Kompleks Genom Analiz Uygulamaları

Tamam Genom Meclis ve T2T Projects

Telomereto-Telomere (T2T) Konsülasyonun 2022 yılında ilk gerçek insan genomunun başarısını, zorlu Y. Benzer çabaların da dahil olmak üzere, birçok diğer türün eklediği gibi, uzun süreli nanopore okuması ve >70 × kapsaması, daha önce tamamen yeniden yapılanmaların tam olarak uygulanmasına olanak sağlar.

Yapısal Variant İnsan Hastalığı

Uzun süreli sequencing, insan genomlarında yapısal biçimleri keşfetme ve karakterize etmek için altın standart haline geldi. Araştırmalar, on binlerce SV'yi genoma katalogladı, birçok eksik veya kötü bir şekilde çözülür, uzun süreli standart exome veya sequencing ile ilgili olarak basit bir haritalamaya izin veriyor.

Nüfus Genetik ve Evrimsel Araştırmalar

Uzun süreli toplantılardan üretilen yüksek kaliteli referans genomları, büyük, tekrarlanan genomik analizlere (örneğin, büyük apes, uzun süreli sequencing, ailelerin belirli geniş kapsamlı anketlerine ve “pan-jenere” gibi kısa süreli yaklaşımlarla ilişkili olarak ortaya çıkan yapısal çeşitliliğin ilk kapsamlı anketlerine izin verdi.

Kanser Genomları ve Sıvı Biyopsi

Uzun süreli teknikler kanser genomlarına giderek daha fazla uygulanır, büyük yeniden düzenleme, kopya numara değişiklikleri ve epigenetik değişiklikler yaygındır. Uzun süreli araştırmalar kullanarak daha önce belirli yapısal biçimleri ve tilasyon kalıpları yüksek hassasiyetle tespit edebilir.Sektrofik biyopside kullanılan uzun süreli diskogenetik yöntemler için ilerici olmayan kanser izleme ve erken algılama için umut verici değildir.

Meydanlar ve Sınırlar

Bu ilerlemelere rağmen, uzun süreli ayrılıklar birçok kalıcı zorlukla karşı karşıyadır. Per-base doğruluk, gelişmişken, hala düşük derinlikte arama veya metilasyon gibi kısa süreli platformların arkasındaki gecikmeler ortaya çıkabilir.Özellikle homopolimer yollarda ve son derece tekrarlanan bölgelerde, özellikle de bireysel arama düzeyinde, özellikle de yüksek bir genom maliyetiyle karşılaştırıldığında, düşük derinlikte olan 200 $ 'lık bir miktar düşük maliyetli veya metilasyon olarak kullanılabilir.

ultra uzun süreli okumalar için kütüphane hazırlığı, yüksek çözünürlükte, eklenmiş, paraffin-embedd (FFPE) doku veya yüksek çözünürlükte, parçalanma ve DNA hasarı, yumuşak DNA'daki tekniklerin çıkarılmasında zor olabilir.

C ⁇ talepleri de beslenmez. büyük miktarda ham sinyal verileri nanopore dizileyicilerinden (veya HiFi’den büyük BAM dosyaları) önemli depolama ve işleme gücü gerektirir. Gerçek zamanlı baz arama, bir GPU'da mümkün iken, önemli elektrik ve hesaplama kaynakları tüketin.

Outlook ve Future Yol

Önümüzdeki beş yıl, PacBio gibi daha fazla atılım vaat ediyor, ONT, alan uygulamaları için cihazları miniya atmaya devam ederken, yeni sağlam devlet nanoporatörler ve entegre devre sensörleri, doğrulama olmadan maliyetleri artırabiliyor ve maliyetleri azaltıyor.For Concurrently, roman bazlı arama modelleri geliştirmektedir, ONT alan uygulamaları için cihazlarının kullanımını hızlandırmaya devam ederken.In the Chemistry front, to setleri (<2 Mb) Doğrulama olmadan.

Uzaylı transkriptolar ve tek hücreli genomlar ile entegrasyon, uzun süreli ve kısa süreli tek hücreli verileri birleştiren karma yaklaşımlar, kısa süreli yayınlar tarafından kaçırılmış olan hücre tipine özel alternatif splicing ve mutasyonlar ortaya çıkabilir.

Son olarak, “pangenomic” referans genomlarına doğru geçiş, bu teknikler olgunlaşan birçok yüksek kaliteli uzun süreli toplanmaların ortak analiz edildiği, insan genetiklerini nasıl yorumlayacağımızı temel olarak değiştirecektir. Biyolojik araştırma, büyük SVs ve hastalık üzerindeki etkilerini incelemek, bu teknikler olgunlaşmış olarak rutin hale gelecektir. Uzun süreli sequencing teknikleri sadece mevcut genom analizlerini geliştirmekle kalmaz; tamamen yeni biyolojik araştırma biçimlerini tespit edebilme yeteneğine sahiptir, çok sayıda epigenetik işaretin tüm son dereceleri analiz eder ve bu tekniklerin gerçek zamanlı olarak takip etmesi için son derecelendirilmesine olanak sağlar.

Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç

Uzun süreli sequencing teknikleri, karmaşık genomları analiz etme kapasitemizi hızla dönüştürüyor. Kimya, donanım ve hesaplama, PacBio HiFi ve Oxford Nanopore gibi teknolojiler şimdi tek bir deneyden elde edilen bilgileri genişletiyor, ultra uzun süreli olarak ortaya çıkıyor ve bu da genetik özelliklerle -rekan bölgelerde, sentler ve büyük yapısal farklılıklar - epigenekonomi analizleri ile ilgili daha uzun vadeli yaklaşımlar ve entegrasyonlar ile, genetik olarak yapılan tümleme yöntemleri, daha genişliyor.