Hücrelerin Biyolojisi Sen Yaşıyor
Uzun süreli hücre kültürleri ilaç keşfi, toksikoloji, rejeneratif tıp ve temel biyoloji ile ilgili tüm sürekli çizgiler en sonunda temel bir engelle karşı karşıya kalır: Bu durum genetik olarak ilişkili olarak bilinen hücre pro-inflamatuar milieu'nun istikrarlı bir şekilde tutuklanmasıdır.
Anahtar Tesirleri ve Sensaniyet Yolları
Telomere Kısaltma ve Yeniden Tanıma
Her DNA replikasyonu kısa telomerleri - kromozom uçlarında koruyucu kapaklar kritik derecede kısa olduğunda, telomerler DNA hasarı (DDR) p53 ve p21'i aktif hücre döngüsünün tutuklanmasına yol açıyor. Bu çoğaltmak, çoğu insan somatik hücreler için doğal bir sınırdır, bu da yeterli telomer aktivite eksikliğinden yoksundur.
Oncogene-Indük Senness (OIS)
Affüslerin p16 ile reaksiyonları:0)[Dönetici:0)[FONT=0) veya [[Dönemli mutasyonlar yoluyla) in vitro-ep3)INK4a) kültürde, onkojenlerin (örneğin, spontan mutasyonlar yoluyla) aktivasyonu genişlemeyi durdurabilir. OIS, bir tümör-eleyici mekanizma ile hareket eder, ancak düzgün, yüksek büyüme kültüründe istenmeyendur.
Oxidative Stres ve DNA Hasar
Normal metabolizma veya kültür koşullarından (örneğin, yüksek oksijen gerilimi, ışık maruziyeti) DNA lezyonlarına, protein oksidasyona ve lipid peroxidasyona neden olur. Persistent oxidative hasarlar Depresyon ve p53, prematüre standart incubators at atmospheric oksijen (~20%) fizyolojik düzeylerden daha yüksek oksidatif stres (yüzde 1–5%), birçok hücre türüne hız verir.
Epigenetik Deregulation
Histone modifikasyonları ve DNA metilasyon desenleri kültür yaşı ile değişir. heterokromatin işaretlerinin kaybı, gelişimsel genlerin yeniden ifade edilmesi ve değişen kronolojik yol yollarını bağımsız olarak telomer uzun süre boyunca etkinleştirebilir. Epigenetik istikrarsızlıklar yetersiz kalır ve kültür medyası tarafından baskılanır.
Uzun Süreli Kültürlerdeki Senliği Önleme Stratejileri
1. Telomerase Aktivasyonu ve hTERT Expression
Doğaüstü hassasiyetten kaçınmak için en doğrudan yol telomer aktivitesini geri yüklemektir. Birçok hücre türü - birincil fibroblastlar, epithelial hücreler ve mesenchymal kök hücreleri - kediyetik altınit-seçmiş telomerik (hTERT) Bu yaklaşım, yüzlerce nüfus bebekten oluşan telomerleri korumak, diğer kültür koşullarını tartışmak için gerekli değildir. hTERT ifadeler kendi başına dönüşüme neden değildir; sadece proliferatif limitleri genişletir.
2. Kültür Koşulları
In vitro ortamının her parametresi, senatörlerin en başından beri sizi etkiler. Aşağıdaki ayarlamalar etkili olmuştur:
- [FONT:0) Düşük oksijen basıncı.[[DÜT 1:0) 2-5% O2 (en çok doku için donanma) ROS üretimi azaltır, hiposi-inducible faktörler ve gecikmeler sensaniyesi birçok kök hücreler ve birincil hatları, yaşam süresini hipok koşullar altında önemli ölçüde uzatır.
- [FONT:0]Antioksit takviyesi.[[Dönetici:0) Antioksitoksitoksitoksit, vitamin E veya glutathione öncüleri telomerleri ROS'u silebilir ve yüksek dozları koruyabilir; titrasyon önemlidir.
- [FONT:0) Yüksek kaliteli medya ve serum.[DÜT:1] Taze hazır, endotoksitsiz medyayı optimize edilmiş glukoz, glutamine ve piruvate seviyelerinin metabolik stresi azalttığı görülüyor. Fetal bovine serum (FBS) parsel değişiklikler, duyarlılıkları veya düşük FBS takviyeleri kullanarak tanımlanabilir.
- [FONT:0]pH ve osmolality kontrolü.[DÜT:1] Frequent orta değişiklikler sıkı biyokarbonat tamponlama (örneğin HEPES’yi CO2 incubators dışında) tutuklamayı ve osmotic şoklarını önler.
- [FONT:0]Surface kaplamaları ve ekstracellular matrisi.[DÜT:1) Senescence, kendi çevrelerini taklit eden substratlar üzerinde gecikmiş durumda, laminin veya fibronectin kaplamaları. Örneğin, mesenchymal kök kültürü, incelenen matrisler plastiktekilerden daha yüksek proliferatif kapasiteye sahip.
Uzun vadeli geçişler için kültür koşullarını optimize etmek için ayrıntılı bir protokol için, [[DÜT:0)Temiz:DÜSTR:0) Hücre Biyolojisinde (Dönetici:2) kılavuzluk) pratik karşılaştırmalar sağlar.
3. Telomerasebin Ötesinde Genetik Modification
hTERT en yaygın ölümsüzleşme aracı olsa da, diğer genetik müdahaleler, senkronizasyonu tamamlayıcı yollarla ele geçirebilir:
- [FONT:0) Anti-sentez genlerinin ifade edilmesi [/FONT=0][/FONT=0][/FONT=3][/FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=3}[FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=TR=TR=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FONT=FO
- [FONT:0)Knockdown of senescence-associated genlerini.) Silencingur:2|p21) veya [[DÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜDÜ: 16[DÜye Olmayanlar İçindekiler)
- [FONT=0)CRISPR/Cas9 tabanlı yaklaşımlar.[Dönetici:0)[Dönetici:0))[Döneticileri kontrol eden telomerlerin veya onarımlarının telomerlerin -ama en dengeli stratejilerin birleşimi telomerikler ile tepki vermesi, örneğin, s.ATM)[Dönetmelik[Dönetici).
4. Küçük Molecule Senolytics ve Senescence Reversal
Mitsaniyetin önlenmesi yerine, bazı bileşikler, duyarlılıkları seçici olarak ortadan kaldırabilir veya SASP'yi engelleyebilirler. Bunlar proliferatif bir kültürü korumak için daha az kullanışlıdır, çünkü tutuklanmış hücreleri temizler ancak büyümeyi geri yüklemezler. Ancak, bir arada genel sağlık geliştirirler:
- [FONT:0]Dasatinib + quercetin.[[Dönetici] Bu kombinasyon, sensan hücre yükünü in vivo ve in vitro azaltır, ancak bazı birincil kültürlere karşı simaloksittir.
- [FONT=0)Rapamycin.[[DÜDÜŞÜŞÜNCÜŞÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞÜNÜŞ
- [FONT:0]Metformin[Döneticileri için Bilinenler, metformin, Concordl ROS'i azaltır ve AMPK'yi etkinleştirir, böylece mesenchymal kök hücrelerde ve endotel progenitorleri yavaşlayın.
- [FONT:0]Resveratrol ve nicotinamid riboside.[[Döntgen:0) Bu NAD+ öncüleri heterochromatin aktivitelerini güçlendiriyor ve epigenetik senliği geciktiriyor.
Adli bir duyarlılık genel bakış açısına göre, akrepler (kahkahalar) ve (veyan) s.
Uzun Süreli Kültürlerin Pratik Günlük Yönetimi
En optimize edilmiş koşullar ve genetik aletlerle bile, günlük kullanım, senatörlerin koyunda tutulmasının nasıl belirlendiğini belirler. Aşağıdaki operasyonel kurallar sağlam kültürlere yardımcı olur:
- [FONT=0)Limit pasaj numarası.[[Dönder: 1) birincil hatlar için, kriopreserve erken pasajlar ve sadece gerekli olduğu gibi genişletin. Bir geçiş rotası sistemi kullanın (belirli nüfus bebekleri, sadece geçiş numarası değil) ömür boyu izlemek için.
- [FONT:0]Bir aşırılıktan yoksundur.[DÜDÜDÜDÜDÜSÜŞÜNCÜDÜŞÜNCÜŞÜNCÜŞÜNÜŞÜNCÜŞÜNCÜŞÜNÜŞÜNCÜŞÜNCÜŞÜNCÜSİADLER:0) Hücrelerin% 70 oranındaki etkisi, ötesinde değil.
- [FONT:0) Hassas dissocitasyon yöntemlerini kullanın.[DÜT:1] Trypsin/EDTA maruziyeti minimum olmalıdır. Uygun hücreler için aksi veya non-enzymatik dissociasyon tamponları kullanmayı düşünün. Prolonged Trypgasyon hasarları yüzey reseptörleri ve stres yanıtları.
- [FONT=0) Stres işaretleyicileri.[[Dönetici:0)) ve =Dönetici için lekelenmeler, yaygın tutuklamalar öncesindeki doğrulayıcı eylem tespit edilebilir.
- [FONT=0)Cryop protection en iyi uygulamaları.) Yüksek kullanılabilirlikli dondurma medyayı kullanın (örneğin,% 10 DMSO + 90 FBS), kontrollü-te donduran veya sıvı azot buhar fazında depolayın.
- [FONT=0)Batch testi serum ve medya.[DÜT:1] Yeni bir sürüye taahhüt etmeden önce, doyubling zamanlarını ve beştelik inmeleri için bir büyüme eğrisi gerçekleştirin.
Future: Next-Generation Approaches
Alan geleneksel 2D monokat kültürünin ötesine geçiyor. Organoidler, spheroidler ve biyoreaktör kültürler genellikle yenilenme kapasitelerini sergiliyorlar, çünkü o kadar iyi mimik in vivo mimari ve besleyici gradientler. Mikrofluidic perfüzyon cihazları sürekli olarak boşanabilir ve taze ortalık teknolojisini tedarik edebilir, stres. Ek olarak, indüklenen pluri kök hücreler (iPSCs) yakında sınırsız bir şekilde yenilenmez ve istenen otizmli hücrelere ayırt edilebilir.
Bir başka heyecan verici yön, Yamanaka faktörlerinin geçici ifadesidir (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) kısmen yeniden programlanmış hücrelere, epigenetik yaşı, fibroblasts'taki çalışmalar, bu faktörlerin döngüsel ifadesinin, duyarlılıksal yaşam süresini azaltır ve çoğaltmak için "epigenetik gençleştirme" yaklaşımı hala gelişim altında, telomerazidasyona karşı alternatif sunuyor.
Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç Sonuç
Uzun süreli hücre kültürlerini önlemek, telomer biyolojisini, oxidatif stres, kültür ortamı ve genetik istikrarı ele alan bir katman gerektirir; en iyi sonuçlar telomer aktivasyon (vTERT) ile optimize edilen düşük kaliteli medya, yumuşak kullanım ve düzenli izleme. Araştırmacılar, anlamlı sonuçları dikkate almak için -tamamlamalar için -tıplama yaklaşımlarını sağlamak için - en iyi sonuçlar -ve -ve bu teknikleri entegre etmek - bu teknikleri entegre etmek, bilim insanları sağlıklı, proliferatif kültürleri korumak için - anlamlı ve yasal sonuçları göz önünde bulundurmalıdır.