Використання Talens та Zfns в сучасних генетичних дослідженнях
Сучасні генетичні дослідження вводили трансформативну еякуху, керовану розвитком прецизійних інструментів гено-вихідної. Серед новітніх технологій, ТЕН (транскрипт Activator-Like Effector Nucleases) і ZFNs (Zinc Finger Nucleases) виділяють як фундаментні платформи, які дозволили цільової модифікації ДНК довго перед революцією CRISPR. Ці інженерні білки дозволяють вводити подвійні пасма в певних геномних місцях, вивчивши іннатні шляхи клітин - незважний кінець приєднується (NHEJ) або гомологічно-прямізовані дослідження (HDRionto), що досягають високий рівень загальної активності, що необхідної загальної генетичної медицини, що призводить до досягнення високої загальної генетичної патологічної генетичної патологічної патологічної медицини, що призводить до високої патологічної патологічної генетичності, що призводить до високої патологічної патологічної патологічної патологічної патологічної патологічної патологічної патологічної патологічної патологічної патологічної патологічної будови, що призводить до високої ефективності,
Розуміння механізмів TALEN та ZFNs
Оцинкована нуклеаза пальцем: модульна розпізнавання ДНК
ZFNs були першими широко прийнятими програмами, що нуклеази, спочатку описані в середині-1990-х. Кожен ZFN складається з ДНК-біндингового домену, зібраного з білків пальцевого пальця та домену ДНК-дроблення, отриманого з FokI], обмеження ендонуклеази. Індивідуальні модулі пальцевого пальця зазвичай розпізнають тринуклеотидну послідовність. За допомогою декількох пальців в тандемі, дослідники можуть цільові послідовності від 9 до 18 базових пар. Тому FokI повинні дивувати, щоб з'яні положення, щоб зрізати, що наді об'яні ділянки ZNF
Дизайн і складання масивів пальцевих пальців може бути технічно складним завдяки контекстно-залежній афінності - розпізнавання пальцевого пальця може впливати на сусідні пальці. Безперечно, методи, такі як Відкритий (Олігомерований басейн інженерної) і контекстно-залежні збірки покращили передбачуваність. ZFNs використовуються для створення вибивних клітинних ліній, створення трансгенних моделей тварин, а також правильних захворювань, що відбуваються на ранній клінічній стадії.
Транскрипція Активатор-Like Effector Nucleases: Специфіка однонауклеотид
TALENs з'явився близько 2009–2010 як альтернатива правилам простежування. Їх домен ДНК-з'єднання походить від транскриптичних активаторів-подібних ефектів (ТАЛІ), білків, виділених рослинним патогеном Xanthomonas]. Кожен модуль TALE визнає точно один нуклеотид, який визначається двома гіперваріативними амінокислотними залишками, відомий як повторне змінне диреції (RVD). Найбільш поширені парні RVD-нуклеотид є NI для аденіна, HD для цитоін, NG для тиміну, специфічні ДНК може бути специфічна для ДНК
TALENs також використовує FokI] домен дражаю і вимагають парі зв'язування для різання. Збірка TALE повторних масивів може бути досягнута за допомогою клонування Golden Gate або синтезу твердих фази. TALENs, як правило, експонуються вище специфіка, ніж ZFN і нижчої токсичності в клітинах, хоча їх великий розмір (~3 kb на мономер) може бути обмеженням для вірусних векторних поставок. Тим не менш, вони успішно застосовуються в збрази, щури, свині, і людські клітинні лінії, і в декількох прекліні генотерапії ген.
Історичний розвиток та мильні камені
У 1996 році, в результаті чого в кінці 1980-х років почалася подорож інженерних нуклеасів. У 1996 році, Chandrasegaran і колеги з'явилися три‐zinc-finger домена FokI], створення першого ZFN. Цей прорив ввімкнув цільове редагування геномів Drosophila використовується і пізніше в клітинах людини. 2005, ZFNs було використано для зміни CCR5 ген для конферентування ВІЛ-інфекції[FLT], концепціяsN
Технологія TALEN розроблена швидко після структурної освіти білків TALE в 2007 році. Протягом трьох років кілька груп повідомляють про функціональні TALEN для редагування генів в дріжджах, рослинах та клітинах людини. Їх простота знижує бар’єр для академічних лабораторій, щоб прийняти редагування геном, іскриження хвилі відкриття. 2012 року TALENs були використані для створення перших геноміфікованих свиней для моделювання хвороб та дослідження ксенотрансплантації.
Застосування в сучасних дослідженнях
Медичні дослідження та генотерапія
ZFNs і TALENs мають розширену генну терапія для моногенних порушень. У хворобах клітин і бета-талассемії, ZFNs, що спрямований на BCL11A еритроїдний підсилювач реактивації феталевоглобіну експресію. Фаза 1/2 клінічної дослідження (NCT03282656) з використанням ZFNs для редагування гемопоетичних стовбурових клітин, що випробували, що стійке поліпшення гемоглобіну. TALENs використовуються для виправлення IL2RG‐ICed X‐X
Агробіотехнології
Удосконалення культур, TALENs та ZFNs використовуються для створення гербіцидно-тероїдних і хворобобезпечних сортів. Перші торговані TALEN‐edited crop - сої з поліпшеним маслом профілю - розроблений Calyxt і випущено в 2019 році. ZFNs було застосовано для збільшення врожайності рису шляхом збивання негативних регуляторів зерна розміром. Висока специфіка цих нуклеаза зменшує неінтенсивні геномні зміни, які вигідно для нормативного прийняття. [[FLT]]] Детальний аналіз Joung та Sander (2013) [FLT: 1]Натюрма [2[FEN[2[FEN]
Функціональні геноми та модельні організації
Обидві платформи дозволили систематично вибити гени у видах, де ембріональні стовбурові клітини були недоступні. У zebrafish TALENs були використані для створення > 200 цільових мутантів в одноконсортних зусиллях, виявлення функцій генів у розвитку та захворюваннях. У щурів ZFNs порушується p53]] пухлинний пригніч для створення моделей раку. Можливість генерувати точні мутації через HDR за допомогою однотонних олігонуклеотидних донорів розширила репертуар моделей збитків для нейродегенеративних та серцево-судинних захворювань. Дослідники також поєднуються TAL виразкові системи.
Сила та обмеження порівняно з CRISPR‐Cas9
Виникнення CRISPR‐Cas9 (2012) пропонує простий дизайн, багаторазову можливість та високу ефективність, що веде до його широкого затвердження. Однак, TALENs та ZFNs зберігають унікальні переваги. Їх білок на основі ДНК визнання не спирається на довідник РНК, усунення ризику РНК, що генеруються безвідмовними ефектами. Крім того, ZFNs та TALENs експонують більш високу специфікацію для послідовностей з повторюваними або GC‐багатими регіонами, які вимагають цільового завдання CRISPR. Чим більше розмірів цих конструкцій (~4-10 kb) можна фасувати в адено-асоковані стратегії (A‐подвійні) оптимізованих міні-векторів, які оптимізованих уекторів.
Основна обмеження - це вартість та трудова робота, яка вимагає інженера нових ZFNs або TALENs для кожної мети. Хоча CRISPR вимагає лише редизайну послідовності 20-bp, ZFN і TALEN вимагає складання білкового домену та перевірки. Оффеттаревий драж є також занепокоєння; цинкові пальці можуть перенести невідповідні речовини, а TALENs може зрізати на часткових цільових сайтах. Комплексне видалення ‐target профілювання за допомогою методів, таких як Guide‐Seq або CIRCLE‐Seq є важливим для клінічного перекладу. 3 [FLT:] [L:] [[FLT:] [TR] [TR] [FLT:] [[FLT:] [[F1[F] [TR] [F[F]
Майбутні напрямки та підвищення рівнянь
Поточні дослідження спрямовані на підвищення ефективності та безпеки TALENs та ZFNs при зниженні витрат на виробництво. Поспішні в білковій інженерії отримали ZFNs з поліпшеною термоздаткістю та зниженою цитотоксичністю. Структура керована редизайном FokI] варіанти (наприклад, ELD‐KKR та Sharkey) підвищує специфічність дімеризації та каталітичну активність. Для TALENs, алгоритми машинного навчання тепер прогнозують оптимальні комбінації RVD для складних цілей, а також високу хідність золота шлюзування дозволяє легко використовувати масив в один день.
Доставка залишається пляшковим вирізом для віо-додатків. Наночастинки ліпідів та аденотермоасоційовані вірусні вектори рафіновані для гемопоетичних стовбурових клітин та гепатоцитів. Перехідна доставка білків ZFN/TALEN (шкіра, ніж ДНК) зменшує тривале виразування нуклеази та позашталеві події. У сільському господарстві TALEN використовуються для розробки кісеногенних культур, які перевозять природні слони без зовнішньої ДНК. Регуляторний ландшафт може сприяти цими інструментами претероКРИСР за рахунок їх встановленого запису безпеки та прецедента для затвердження ринку.
Нарешті, поєднання TALENs або ZFNs з базовим редагуванням або редагуванням — технології, які спираються на нікоки, а не подвійні ламки — припливають їх утиліта. Наприклад, Zn‐fingerlinked cytidine deaminase може виконувати цільову базу перетворення без подвійних струнких розривів. Опубліковано клінічний хід на ZFN‐на основі CCR5 редагування (Tebas et al., 2014, Новий Англійський журнал медицини[F:4F[F:4]
У висновку, TALENs і ZFNs залишаються життєво важливі в генетичній дослідницькій коробці. Їх відмінні властивості —модульна розпізнавання ДНК, висока специфіка і встановлена безпека — зміяти їх незамінними для певних додатків, особливо коли інструменти РНК не підходять. Як поле рухається до точної медицини і сталого сільського господарства, ці піонерські нуклеази продовжать каталізувати вияви, які покращують здоров’я людини і продовольчу безпеку.