Останні досягнення в геномах мають глибоке розширення нашого розуміння того, як генетичні варіації приводів здоров'я, захворювання та відповідь на наркотики. Геном людини harbors мільйони варіантів, але велика більшість залишаються нехарактеризованими з точки зору їх функціональних наслідків. Традиційні методи вивчення індивідуальних варіантів - наприклад, локація сайту, спрямоване на низькопродуктивні заболочення, що занадто повільно і економічно вигідно задовольняє вимоги сучасної геноміки. Висока пропускна здатність функціонального скринінгу (HTFS) виник як трансформативне рішення, що дозволяє одночасно функціональний аналіз тисяч до мільйонів варіантів, що визначаються в одному експерименті. Цей підхід є прискоренням функціонального визначення

Введення до високоточних функціональних екранів

Високопродуктивна функціональна скринінг відноситься до набору експериментальних методів, які систематично перевіряють вплив численних генетичних змін на меасучу біологічну читанню. Принцип ядра полягає у створенні великих бібліотек послідовностей варіантів, введенні їх у відповідну клітинну модель, а потім сортувати або вимірювати клітинки на основі фенотипу відсотків (наприклад, експресії гена, клітинної фітнесу, протеїнну активність). Потенції в синтезі ДНК, осаду та автоматизації дозволили розробити, побудувати та тестувати бібліотеки, що містять десятки тисяч варіантів в питанні тижнів. Ці методи мають вирішальне значення для інтерпретації величезної кількості варіантів, що виявляються великим значенням, особливо актуальними, оскільки

Основні технології Схема високоточного скринінгу

Кілька потужних технологій підпінюють сучасні HTFS, кожен з власних міцностей і додатків.

CRISPR-Одно екрани

Технологія CRISPR-Cas9 має революцію функціональних геномів, що дозволяє точно редагувати геноми в масштабованому порядку. У типовому басейні екрана CRISPR бібліотека одноосібних напрямних РНК (sgRNA) призначена тисячі геномних сайтів, які надходять в клітини, що значно виражають Cas9. Отримані редагування — інертації, видалення або точкові мутації — пожовтих дослідників для оцінки ефекту точного стану втрат (CRISPR збивання або CRISPRko), активація (CRISPRa), або репресія (CRISPRi) на фенотипі. Більш розширені варіанти мітентів дозволяють укладати певні чинники, як мітатори

Масивно Параллель Репортер Асаси (MPRAs)

МРРА – це метод вибору для засвоєння впливу тисяч нормативних варіантів на експресію гена. У типовому МРРА, бібліотеку послідовностей ДНК (все, що містить варіант відсотків) клонується потоком мінімального промотора і геном репортера (наприклад, GFP, luciferase або штрих-код). Бібліотека вводиться в клітини, а велика кількість репортера РНК або білків квартефікована методом осадки. Порівнявши вихід до бібліотеки вводу, дослідники можуть вимірювати, як кожен варіант змінює транскриптову активність. МРРС використовують для систематичного оцінювання варіантів ризику GWAS, виявлення функціональних негативних варіантів дискриктивів, визначення

Інші підходи до високої кваліфікації

Стійкість мутагенезу поєднується з глибоким стисканням (наприклад, глибоким мутаційним скануванням) дозволяє функціональне характеризація кожного можливого одно-мінокислотного заміщення в білковому домені. Синтетичні біологія інструменти, такі як комбіновані бібліотеки нормативних послідовностей, допомагають розкрити послідовні детермінанти пролизування, перекладу та стабільності білка. Крім того, такі методи, як високопродуктивна флуоресцентно-активована клітина, що сортує (FACS) на основі конструювання мітента, дозволяють збагачення клітин з бажаними ефектами.

Останні інновації та методичні досягнення

Поле швидко розвивається, з новими методами, що підвищують роздільну здатність, зменшують вартість та інтегрують додаткові типи даних.

Інтеграція з одноканальним стекеруванням

Одним з найбільш захоплюючих останніх розробок є сходження на пулі екрани з одноклітинними читунами (наприклад, Perturb-seq, CROP-seq). Замість міркування середньої кількості населення ці підходи захоплюють траномину, протеомічні або епігномічні профілі з окремих клітин після перебурювання. Це розкриває клітинно-фізичні ефекти, гетерогенність в варіанті впливу, а плейотропні наслідки генетичних змін. Одноклітинний дозвіл особливо цінний для вивчення процесів розвитку, імунних реагування, а еволюція раку, де середні середовища можуть маскувати важливі підпопуляції.

Машинне навчання для пріоритетної пріоритетизації

алгоритми машинного навчання тепер невід'ємні для робочого процесу HTFS. Вони допомагають розробляти бібліотеку варіантів, прогнозуючи, які мутації, швидше за все, є функціональними (наприклад, на основі еволюційної збереження, структури білка або хроматину стану). Після скринінгу моделі ML можуть інтегрувати масштабні дані для класифікації варіантів як патогенні або доброякісні, передовімати кандидатів на перевірку, а також основні механізми запліднення. Глибокі архітектури навчання, такі як конв'юнкційні нейромережі (CNNs) і трансформатори, які навчаються на масивних геномних даних, показали вражаючу точність при прогнозуванні функціональних ефектів і рафінуються через безперервні відгуки з експериментальних екранів.

Інтеграція мульти-омік

Комбінація HTS з іншими шарами оміків — наприклад, протеоміка, метаболоміка або епігноміка — це більш повне зображення функції варіанту. Наприклад, муфта МПРА з хроматиновими доступністю аси (наприклад, ATAC-seq) може виявити, чи впливають нормативні варіанти фактора транскрипту в контекстно-залежній формі. Такі інтегративні підходи є важливим для розуміння комплексного переплескування між генотипом і фенотипом.

Застосування в науково-дослідній та лікарській медицині

HTFS вже трансформує нашу здатність інтерпретувати геномічні зміни та перевести її в клінічну практику.

Функціональна анотація Варіантів нестереності

Головний пляшковий балон в клінічних геномах є високою пропорцією VUS, що повідомляються в генетичних тестах. HTFS може систематично оцінити функціональний вплив тисяч VUS в генах, які відповідають спадковим розладам, наприклад BRCA1], TP53, і CFTR]. Забезпечуючи функціональні докази, ці екрани допомагають перекласувати варіанти як доброякісні або патогенні, безпосередньо покращуючи діагностичний урожай і управління пацієнтом.

Фармацевтика та розвиток наркотиків

Випробування генетичних варіантів, які змінюють відповідь препарату, дозволяють прогнозувати несприятливі реакції або відсутність ефективності. У виявленні препарату HTS використовується для формування мітацій на основі міток на основі раку, що допомагає розробити інгібітори післягенерації. Крім того, шляхом профілювання повного мутаційного ландшафту лікарських цілей, дослідники можуть очікувати, як пухлини можуть розвиватися стійкістю і розвиватися комбінації терапевтичних препаратів відповідно.

Розуміння механізмів хвороби

Види великих варіантів бібліотек у типах клітинок, що містяться у захворюваннях (наприклад, нейрони, кардіоміоцити, імунні клітини) покривають причинні варіанти і шляхи, які впливають на. Наприклад, дослідження використовували екрани CRISPR для виявлення основних генів у ракових клітинах, виявлення нових терапевтичних вразливостей. У нейророзвивальних розладах MPRAs мають гострі мутації, які порушують регулювання генів при кортисичному розвитку, забезпечуючи механікоінсайти в умови, як аутизм і шизофренія.

Поточні обмеження та перспективи

Незважаючи на свою владу, HTFS зіткнувся з кількома викликами, які повинні бути адресовані для виконання свого потенціалу.

Скальливість і вартість

Хоча вартість синтезу ДНК і стікінгу різко скидається, масштабні екрани — особливо ті, які вимагають користувацького клітинного ліній, одноклітинного стиску, або комплексного фенотипного осей — дорожчі. Поліпшення майбутнього в бібліотеці (наприклад, синтез комбінаторного синтезу), автоматизації та мініатуризації (наприклад, платформи крапельного типу) знизить витрати і демократизують доступ до цих технологій.

Біологічна специфікація та специфікація контексту

Варіанти впливу можуть бути високо залежними від типу клітин, генетичного фону, навколишнього середовища та епігенетичного стану. Варіант, який є доброякісним в одному контексті може бути патогенним в іншому. 3D геном архітектури, регулювання спіралі та післятрансляції модифікації додають шари складності, які важко захоплювати в спрощених моделях систем. Посланники в органоїдах, кокультурах, а також в vivo скринінгу (наприклад, за допомогою CRISPR в мишей або zebrafish) починають вирішувати контекстну залежність, але значна робота залишається.

Аналіз даних та інтерпретація даних

Обсяг даних, що генеруються HTFS, є меншими мільярдами даних, які відслідковуються, є надійними обчислювальними трубопроводами для контролю якості, нормалізації та статистичного виклику. Ці позитивні результати, що стосуються впливу на відставку, біази бібліотеки, або стохастичного шуму повинні бути ретельно керовані. Крім того, інтеграція даних HTS з іншими геномальними ресурсами (наприклад, ]ENCODE], ClinVar, gnomAD) залишається проблемою. Намагає стандартизувати метадані, розвивати загальні моделі даних, і ділитися результатами через публічні репозиторії [F2lin, макс.

Висновок

Високопродуктивна функціональна скринінг переходить з спеціалізованої техніки до кутового каменю сучасної геноміки. Допомагаючи систематичну оцінку генетичної варіації, ці методи стимулюють відкриття функціональних елементів, покращують варіант інтерпретації для клінічних геномів, забезпечуючи нові уявлення про хворобу біологія. Технології, що включають одноклітинну роздільну здатність, інтеграцію машинного навчання, багатооміки підходи, які обіцяють додатково рефлювати наше розуміння того, як генетичні варіанти формують здоров'я людини. Як зниження витрат і методи стають більш доступними, HTFS стане більш важливим інструментом для дослідників і клінік, що допомагає містити розрив між генотипом і фенотипом.

Для всебічного огляду функціональних технологій геноміки див. огляд Canver та ін. (2017) в Nature Reviews Genetics. Додаткові ресурси для визначення варіантів можна знайти за допомогою ClinVar Database і NH Genome Sequencing Program].