Розуміння викликів культурного забезпечення та кісткового мозку

В'язкі і кісткові тканини представляють деякі з найбільш поміщених перешкод в початковій культурі клітин через їх унікальні структурні та біохімічні властивості. Дозування, зокрема, артикулярний хрящ, є аваскулярним і містить проносне населення хондроцитів, що вкладаються в щільної позаклітинної матриці (ECM), багатих колагеновим типом II, агреканом, і протеогліканами. Ця матриця не тільки протистоє ферментативної травлення, але і обмежує діфузії поживних речовин, роблячи відновлення клітин і подальше розмноження великого завдання.

Стратегії успішного зольового та культурного лікування

Ензиматичний травлення

Оцінка клітинок з щільних сполучних тканин є ферментативним травленням. Колагенез (типи I, II, або суміш) є найбільш широко використовуваним ферментом, оскільки він деградує рідні колагенові клітковини, що знімають перетравлені клітинки. Для хрящів, дворівневе травлення часто підвищує життєздатність: спочатку, коротке лікування з трипсину або проносом для видалення поверхневих протеогліканів, після чого тривала інкубація (4-18 годин) з колагенезом при низьких концентраціях (0.1-0.2% w/v). Для кістки, поєднання колагенів і декольтелейтазиту (не зне зне зне зондування (не з'єколе (не з'єзом)

Декальфікація тканин для боку

Перед заплідненням кісткової тканини необхідно декальфікувати для розм'якшення мінеральної матриці. Два первинних підходи є розм'якшувальні агенти (наприклад, EDTA) і кислоти (наприклад, гідрохлорид або хімічна кислота). EDTA при нейтральному pH є перевагою для досліджень, які вимагають високої клітинної життєздатності, оскільки вона подрібнює іони кальцію без пошкодження клітинних білків. Типові протоколи інкубації фрагменти кісткової тканини 0,5 M EDTA (pH 7.4) при 4°C протягом 24-72 годин, зміна розчину щодня. Прискорене декальфікування швидше, але більш агресивно, це часто є критично за наявності механічніймотивності, дезінфікалізаційної тканини, дезування

Механічна дезекція та мікродизація

Для дуже маленьких біопсій або коли ферментативне травлення є непрактично, можуть застосовуватися механічні методи. Мікророзріз під стереомікросист дозволяє точно ізоляції хрящів або трав'яних кісткових чіпсів, мінімізуючого забруднення з навколишніх тканин. Підсумкова фарширація з скаблами створює крихітні екпланти, які можна помістити безпосередньо в культурні страви (вирощування рослин). Хоча це значно менше клітин спочатку, виростання клітин з висадних країв може бути значним протягом 7-14 днів. Механічне розсіювання також може поєднуватися з ферментативними процедурами для поліпшення клітинного відновлення, особливо з фібро-запилення або росту.

Використання факторів росту та сигналізації Molecules

Після ізольованих, гондроцитів і остеобластів вимагають специфічного фактора росту добавки для проліферату і підтримки їх фенотипу. Бон Морфогенезні білки (BMP‐2, BMP‐7) і Трансформація фактор росту ‐beta (TGF , зокрема, TGF ⁇ 1 і TGF ⁇ 3) є важливим для просування гондрогенезу і остеогенезу. Фібропластовий фактор росту‐2 (FGF‐2) і Insulin‐like фактор росту‐I (GF‐I) часто додаються для підвищення рівня проліферації і затримки senescence. Типові концентрації діапазон від 1–50 ng/L

Оптимізація культурних медіа та добавки

Клітинна культура середнього вибору безпосередньо впливає на клітинну поведінку. Для гондроцту, високотемпулькоза Дюблекко модифікований орел середньої (DMEM) доповнюється ГлютаMAX, неоперативними амінокислотами, і буфером HEPES є загальним. Остеобласти тривають в α‐MEM або DMEM з зниженим кальцій, якщо мінералізація повинна бути індукована пізніше. Концентрація сироватки та періодична консистенція є критичними; деякі лабораторії використовують 20% цитогену для першого проходження для поліпшення вкладення низьких зразків моніторингу. Антибіотики (penicillin‐streptomycin) та антифенолтоксиницин)

3D системи культури та лісосплави

Двовимірна моношарова культура може викликати дедиферентність хондроцитів (збиток колагену II і агреканської експресії) і остеобластного розплавлення. Тритомні системи краще мимити рідну мікросередовища. Пельтські культури (центрові агрегати клітин), мікромаси культури, гідрогелеві акапсуляція (агарос, альгінат, колаген або гіалуронова кислота) часто використовуються для підтримки фенотипу. Біореактори, які застосовують циклічні стиснення або лікеротичний стрес, додатково підвищують вироблення матриці та вирівнювання клітин. Для кістки, пористопластикові пластики кладки .

Контроль якості та характеристика ізольованих клітин

Після ізоляції і культури, це домішне для перевірки ідентичності клітин і чистоти. Для хондроцитів позитивні маркери включають колаген тип II, агрекан, ОКС9, і хрящів олігомерних матричних білків (COMP). Остеобласт маркери включають Runx2, остерікс, лужний фосфатаза, а остеокальцин. Флоу цитометрію, кількісний ПЛР і імунофлюоресцентний комплекс - стандартні методи. Видатність повинна бути переоцінена після кожного проходження; зниження нижче 70% вказує на стрес. Карітіпінг може контролювати хромосомну стійкість при тривалому розширенні клітини, що містяться при тривалому розширенні, що містяться.

Загальні Питпади та усунення несправностей

Часто виникають питання при культуруванні клітин з хрящів і кісток. Діє надходження клітин може бути адресований шляхом розширення часу засвоювання (з безпечні межі), використовуючи свіжі ферменти, або поєднує ферментативні та екплантаційні методи. Bacterial або грибкове забруднення - це постійна загроза, особливо при роботі з хірургічними зразками; ретельне змивання в стерильних блонгах, що містять 3 × антибіотики перед обробкою знижує ризики. Дедиферентність

Технології майбутнього та технології Emerging

Останні досягнення є поштовхом до меж, які можна досягти при дефіциті клітинних популяцій з скелетних тканин. Одноклітинний РНК-відкладок виявляв несподівану гетерогенність серед хондроцитів і остеоцитів, що дозволяє більш цільові стратегії культури. Органоїдно-міротка моделі, які інтегрують кілька типів клітин (хондроцити, остеобласти, ендотеліальні клітини) розроблені для вивчення остеоартриту і кісткового ремонту. Мікрофлюїдні платформи дозволяють перелизувати культуру кісткових і хрящових рослин, зберігаючи життєздатність протягом тижнів. Генуальні інструменти для РСР-Cas9 можуть бути використані для дослідження

Висновок

Успішно культуруючі клітини з хрящів і кістки вимагає багатостороннього підходу, що поваги унікальної біології цих тканин. Ретельний вибір ферментативних протоколів травлення, методів декальфікації, коктейлів фактора росту та культурних платформ різко покращує урожай клітин та фенотипну стійкість. Рогорний контроль якості забезпечує, що клітини, що використовуються в потоках, є автентичними та функціональними. Приймаючи ці стратегії, дослідники можуть розблокувати потенціал скелетних клітинних моделей для адвокації регенеративної медицини, тестування препарату та фундаментальне розуміння культуро-рухових захворювань.

Для детальних протоколів про ферментативну травлення див. Натурні протоколи] колекції; для інструкцій фактора росту, див. Stem Cells Translational Medicine; і для методів декальцинації, консультуйтеся PubMed‐indexed method.