Утилізаційні магнітні бісеринки для клітинного поділу в культурі

Вступ до магнітної бісероплетіння клітинного поділу

Сепарація клітин - це техніка для стразу в сучасному біологія і медицині, що дозволяє дослідникам ізолювати специфічні клітинні популяції з гетерогенних сумішей для аналізу потоку, культури або лікувального використання. Серед різних технологій сепарації, магнітні методи на основі бісеру набули широке прийняття через їх поєднання швидкості, простоти і ніжне поводження. Ці методи спираються на надпарамагнітні бісеринці, що використовуються в фундаментальних дослідженнях, клінічних діагностиці, і виробництві клітин.

Основи магнітних бісерин

КДП часто бувають сферичні частинки з діаметрами, починаючи від нанометрів до мікрометрів, складається з полімерної або оліки матричної матриці, що просочують магнітними наночастиками (частотного залізобетону, Fe_{3_{]O_]4 або γ-Fe₂]₃]). Ключове властивість є надпамагнетизмом:3] або γ-Fe}}

Принципи магнітної клітинної сепарації

Процес поділу можна розділити на два основні підходи: позитивний вибір і негативний (виписання) вибір. У позитивному підборі бісеринок охочують до антитіл, які розпізнають цільову клітинку населення. Після інкубації клітинки з бісеру захоплюються магнітним полем, при цьому непідйомні клітини відкидаються. У негативному підборі бісеринок зв'язуються з небажаними клітинами, які магнітно знімаються, залишаючи ці клітини, які передаються намистинами. Цей останній метод краще, коли ці клітини є рідкісними, крихки, або не повинні бути позначені для функціональних досліджень.

Етапи магнітного розділення

Продукція шамплика: Дегрегація тканин, градієнтовне центрифугування, або ліз еритроцитів для отримання одноклітинної підвіски. Фільтрація через 30–40 мкм сітки часто виконується для видалення курчат.
Incubation з магнітними намистинами: Підвіска клітинки змішується з попередньо визначеною кількістю атома з бісеру-антиті. Умови згортання (час, температура, агітація) оптимізовані для максимального зв'язування, при цьому мінімізації неспецифічної адгезії.
Магнітне захоплення: Суміш поміщається в магнітне поле (на основі постійного магніту в колонці, трубці або пластинному форматі). З бісеру комірки змітають на магніт, при цьому непідіймаються клітинки.
Запобігання кроків: Кілька мий з буфером (частотних PBS з 0.5% BSA і 2 мМ EDTA) видалити забруднюючі незнімні клітинки і залишкові намистини.
Recovery: Для позитивного вибору, захоплені клітини можна розводити, видаливши магніт і переадресуючи гранулу. Крім того, клітини можуть використовуватися безпосередньо на магніті для наступних засобів.

Види магнітних систем розділення

Для різних рівнів автоматизації доступні кілька комерційних платформ, які оптимізовані для різних рівнів пропускної здатності та автоматизації. До найбільш поширених відносяться:

Системи на основі стовпців (наприклад, Miltenyi Biotec MACS): Клітини проходять через сталеву вовну колонку, розміщену в міцному магнітному полі. Затримуються клітинки з бісеру, при цьому нелаблені клітини, що протікаються через. Колонка промивається, а потім знімається з магніту, щоб змащувати межу. Ця система може обробляти великі клітинні числа (до 10⁹]) і досягти високої чистоти.
>Системи на основі труб або пластин (наприклад, Динамо, StemSep):] Клітинки, змішані з намистинами, розміщені в трубці або мікроплаті біля магніту. Кульки з бісеру витягуються збоку або дна, а наднатурант знімається. Цей підхід простий і швидше, але може мати нижній пропускний зв'язок.
Microfluidic devices: Використання мікроканалів з інтегрованими магнітами або магнітними градієнтами поля для окремих клітин на рівні одноклітинного типу. Ці перспективні для рідкої ізоляції клітин, але ще не є основною.

Переваги над традиційними методами

Розширення магнітної пасти дає кілька переваг у порівнянні з сортуванням цитометрії (FACS) або густини градієнтовного центрифугування:

Speed: Типові протоколи приймають 30–60 хвилин, у порівнянні з годинами FACS, що робить його придатним для обробки декількох зразків одночасно.
Scalability: ⁵ до 10¹⁰] клітинки можуть бути оброблені в одному рядку, в залежності від системи. Це важливо для клінічно-масштабних клітинних терапевтичних терапевтичних патологій.
Simplicity: Немає дорогих приладів (тільки магніт необхідний) і мінімальних тренувань оператора. Протокол є прямим і відтворюваним.
Потенційна обробка: Шейрові сили низькі, а клітини не піддаються високому тиску або електричному полів. Видатність, як правило, перевищує 90%.
Версатильність: Застосовується для декількох типів клітин, включаючи первинні клітини, стовбурові клітини, бактерії та навіть підклітинні органели. Бісери також можуть бути функціональні для білкового або нуклеїнового кислотного захоплення.

Розгляд та обмеження

Незважаючи на свої переваги, магнітне відділення бісеру має печерати. Видалення бісеру необхідно враховувати для додатків, де бісер може заважати, такі як функціональні засмаги або пересадки. Деякі системи дозволяють ферментативну або механічну детагментацію бісеру, але це може вплинути на в'язкість клітин або вираз маркера. Крім того, зв'язування бісеру до поверхневих антигенів клітин може викликати сигналізацію або активацію, чергуючи клітинну поведінку. Для негативного вибору ефективність видалення повинна бути підтверджена з цитометрією потоку. Нарешті, вартість може бути значним для масштабних досліджень, хоча багато протоколів дозволяють повторно використовувати намистини для обмежених циклів.

Застосування в науково-дослідній та лікарській медицині

Для біомедицини використовуються магнітні розділи клітинок. До основних напрямків відносяться:

Імунологія

Ізоляція підсетів клітин T (наприклад, CD4+, CD8+), клітин B, клітинок природного вбивця, дендритичних клітин, моноцитів для функціональних засоб, профілування цитокінів, або експериментів з передачі. Негативний вибір є перевагою для доручених клітин T, щоб уникнути активації.

Дослідження раку

Збагачення циркуляційних пухлинних клітин (ЦКТ) крові за допомогою анти-EpCAM або анти-HER2 бісер. Це дозволяє неінвазивний моніторинг пухлинного прогресування і реагування на лікування. Аналогічно, стовбурові клітини можуть бути збагачені на основі виразу CD44/CD24.

Біологія стовбурових клітин

Позитивний вибір гемопоетичних стовбурових клітин (CD34+) з кісткового мозку або мобілізованої периферичної крові для трансплантації. Мезенхімальні стовбурові клітини (MSC) часто виділяються негативним вибором для видалення небажаних клітин.

Регенеративна медицина

Виробництво клітинної терапії спирається на магнітне поділ для очищення терапевтичних популяцій клітин перед настійкою. Наприклад, клітини Т для терапії CAR-T виділяються магнітними намистинами перед генетичною модифікацією.

Мікробіологія

Магнітні бісеринок, покриті антитілами, специфічними для бактеріальної або вірусної антигенів, дозволяють виявити або ізоляції збудників з складних зразків. Це використовується в безпечності харчових продуктів і клінічній діагностиці.

Майбутні напрямки та інновації

У поле продовжує розвиватися. До останніх розробок відносяться:

Multiparametric поділ: Використання декількох типів з різними розмірами / електромагнітними властивостями для ізоляції декількох популяцій одночасно.
Автоматика та мікрофлюїдіка: Інтеграція з рідкими роботами для високопродуктивної, низької кількості зразків.
Продукції з бісеру: Біорозкладні бісеринки, які розростаються після внутрішньої обробки, або нанорозмірні бісеринки, які можуть використовуватися для внутрішньоклітинної доставки.
Комп’ютеризацію з іншими технологіями: Попередній з магнітними намистинами, які слідують FACS для ультра-привидних популяцій.

Як зріла технологія магнітної бісеринок, швидше за все, стане ще більш невід'ємною для персоналізованої медицини і клітинних терапевтичних захворювань.

Висновок

Магнітне відділення клітинної пасти перетворило шлях дослідники ізолювати і очистити конкретні типи клітин від складних сумішей. З його поєднанням швидкості, простоти і дбайливого поводження є незамінним інструментом як в базових дослідженнях, так і клінічних додатках. Розуміння принципів, вибору відповідної системи, і оптимізації протоколів є вирішальним для отримання високої чистоти, вихійних клітин. Оголошені розробки обіцяють навіть більшої функціональності і інтеграції, що забезпечення того, що магнітне відділення бісеру залишається кутовою технікою протягом багатьох років.

Для подальшого читання: Miltenyi et al. – Розширення магнітних клітин (Nature Biotechnology)], ]Огляд магнітних намистин в клітинній ізоляції (Журнал методів імунології), Sigma-Aldrich Технічний посібник на магнітних бісерінках