Хроматографія як інструмент для виявлення метаболоміки та біомаркера

Капілярний електрофорез (CE)

CE відокремлює іони на основі їх електрофоретична мобільність] в вузькому капілярі під електричним полем. Він особливо ефективний для , високополярний] і , заряджених метаболітів, таких як нуклеотиди, органічні кислоти і фосфорильні сполуки. CE-MS пропонує відмінну ефективність поділу і низьку споживання зразків, хоча це рідше використовується, ніж LC або GC.

Інтеграція хроматографії з масою спектрометрією

Методика гіфенування – GC-MS, LC-MS, CE-MS – це задній функціональний спектрометрія. хроматографічне поділ зменшує іонну пригнічення і дозволяє мас-спектрометрам аналізувати сполуки індивідуально. Високо-регенераційна мас-спектрометрія (HRMS)] (наприклад, Q-TOF, Orbitrap) забезпечує точні вимірювання маси для впевненої ідентифікації метаболіту. Tandem-модеометрія (MS/MS).

Метаболоміка Робочий процес

Підготовка зразків

Підготовка зразків Proper є критичним. Метаболіти швидко перевертаються, тому метаболізм повинен бути quenched відразу (наприклад, холодний метанол). Extraction методи, такі як біфазний екстракція рідини-рідини (наприклад, метанол / хлороформ / вода) окремі полярні та неполярні фракції. Приклад деріватизация] для GC-MS або , які є загальними полярними ([F7:2]

хроматографічні дані спектрометрії виявлення пектак, вирівнювання] через зразки, а нормалізація] (наприклад, загальний обсяг іонного рядка або внутрішній стандарт). Інструменти, такі як XCMS, MZmine, і Compound Discoverer автоматичноmate ці кроки. Statistic analysis[ - Основний компонентний аналіз (PCA), часткові принаймні квадрати-дискримінантний аналіз

Метаболоміка Підходи

Нетаргетовані метаболоміка

Нетаргетовані метаболічні речовини, спрямовані на виявлення якомога більше метаболітів, як це можливо без попереднього знання. Глобальні профілювання] генерує гіпотези про метаболізмі перебурень. Хроматографія повинна бути широкою або декількома колонами, які використовуються. Наприклад, подвійний шармнний підхід (RP-LC і HILIC) охоплює як полярні, так і неполярні сполуки. Незабуті дані є напівкількісне і вимагають ретельного валідації.

Цільова метаболоміка

Цільові метаболіка зосереджені на кількісному визначенні визначеного набору метаболітів, часто біомаркерів. Стабле ізотоп-лабелізовані внутрішні стандарти дозволяють абсолютну кількісну кількісну здатність. МРМ на потрійних чотирикутних інструментах забезпечує високу чутливість і специфічність. Хроматографія оптимізована для цільових сполук, часто з коротшими часами запуску для високого пропускного стану.

Роль хроматографії в Biomarker Discovery

Випадковий фаза

У біомаркері відкриття хроматографії виділяють комплексні біологічні рідини (плазма, сеча, екстракти тканин) для виявлення метаболітів, що корелюють з хворобою. Наприклад, броньовані амінокислоти (BCAAs)] були виявлені як ранні маркери інсулінорезистентності з використанням LC-MS. Незабутові дослідження порівняли когорти, а сотні функцій кандидата зводяться до декількох десятків через статистичне фільтрування.

фаза перевірки

Промісні біомаркери повинні бути втілені в більших, незалежних когортах. Хроматографія забезпечує репродукцію, необхідний для перевірки. Затвердження часової стабільності та точності маси забезпечує послідовну ідентифікацію. Методна перевірка включає оцінку лінійності, ліміти виявлення, точність та точність. Вивірений аналіз є важливим перед клінічним перекладом.

Клінічний переклад

Перехід з досліджень до клінічної діагностики вимагає міцних, високопродуктивних методів. Хроматографічні запади для біомаркерів, таких як homocysteine (LC-MS/MS) і вітамін D метаболітів (LC-MS) вже використовуються в клінічних лабораторіях. Автоматизація (наприклад, онлайн SPE, що поєднується з LC-MS) зменшує ручне обслуговування і збільшує пропускну здатність.

Випадкові дослідження в біомаркерах захворювання

Рак Метаболоміка

Ракові клітини експонуються змінним метаболізмом – Warburg ефект (aerobic гліколіз). Хроматографія ввімкнула відкриття підвищеного лактату, змінено проміжні показники циклу TCA, а також зміни метаболізму нуклеотиду. Наприклад, 2-гідроксигтарат] є анометаболитом у IDH-мутантних гліомаах, виявлених GC-MS. Ліпомітіка з використанням LC-MS розкрила змінені фосфоліпідні профілі в грудному і простатевому раку.

Діабет і метаболічний синдром

Метаболічний синдром передбачає дерегуляція ліпідів, амінокислот та глюкози. Виявлено хроматографічні дослідження BCAAs], ароматичні амінокислоти (тиросину, фенілалалінін), а acylcarnitines, як предикторидний тип 2 діабет. ЛК-MS, що профілування керамидів та діакілгліцеринів посилань ліпідний обмін на в косулінній стійкості. Ці великі маркери тепер дійсні

Нейродегенеративні захворювання

Альцгеймер, Паркінсон, АLS залучають дисфункцію метаболізму в мозку і периферії. Lipidomics] з використанням ЛК-МС виявляють зміни у сфропідах і стерильних речовинах в цереброскопічній рідині. Polyamine рівні (спермідин, кладокцин) змінені в Альцгеймері, виявлених ГРІІК-МС. Хромографічні методи допомагають визначити підписи метаболіти, які корелюють з когнітивним зниженням.

Виклики та рішення

Матрикс впливу і Іон Суппресія

Ко-елюючі сполуки можуть пригнічувати іонізацію в MS. Поттер хроматографічний дозвіл зменшує ко-елютіон. Використання ізотоп-лабелі внутрішні стандарти] компенсує матричні ефекти. Двовимірна хроматографія (LC ×LC) або фракційна фракція може додатково очищати зразки.

Відповідність даних

Інтерлабораційна мінливість залишається родильною. Стандартизовані протоколи, зразки контролю якості та / поперечно-лабораторні дослідження] (наприклад, використання NIST SRM 1950) покращують відтворюваність. Час закінчення індексації з alkylamines або інші калібрани допомагають вирівняти дані через пробіги.

Великі Скальєзнавство

Метаболоміка для населення вимагає обробки тисяч зразків. Автоматизований препарат зразків (роботиків) і U(H)PLC з короткими стовпчиками (наприклад, 5-хвилинні градієнти) дозволяють високий пропускний стан. Виправлення штрихів] алгоритми (наприклад, корекція на основі QC) адреса drift over довгих послідовностей.

Майбутнє Outlook

Сепарації високої роздільної здатності

Поспішні розробки в технології колонки (наприклад, sub-2 μm core-shell частинок) і іонна мобільність спектрометрії] (IMS) додають вимір поділу на основі зіткнення перерізу. LC-IMS-MS] може вирішувати ітерори і збільшити пікову потужність. Комплексний двовимірний GC (GC × GC) отримує тяг для ткацьких метаболом

Автоматизація та мініатюризація

Мікрофлюїдні пристрої та дігітальні мікрофлюїдіки розроблені для підготовки та поділу зразків на дюйм. Автоматизовані онлайн SPE-LC-MS системи знижують ручні кроки, підвищуючи відтворюваність. Ці технології зроблять хроматографію більш доступним для клінічних лабораторій.

Інтеграція з машинним навчанням

Аналізуючи час зберігання машин, допомагають в анотації метаболіту від спектрів MS/MS, і виявляти візерунки в великих даних. Об'єднання даних збереження хроматографії з масовою спектральною інформацією покращує впевненість в ідентифікації біомаркера. Деп-вчитель] моделі можуть також запропонувати оптимальні умови для розділення.

Висновок

Хроматографія залишається незамінним інструментом для виявлення метаболомів та біомаркера. Від розділення тисяч метаболітів для перевірки клінічних біомаркерів, хроматографічних методів забезпечують дозвіл, відтворюваність та кількісну точність, необхідну. Як інструментація розвивається – з більш високими тиском, краще хемістрів стовпців, а також інтеграцію з іонною мобільністю та автоматністю – хроматографія продовжує приводити прогрес у точності медицини та метаболізмі фенотипування. Дослідники повинні враховувати сильні сторони кожної техніки (GC, LC, CE) та дизайнерські процеси, які максимально задовольняють якість даних.

Для подальшого читання див. Натюрморт Metabolomics предмет сторінки, Chromatography Online ресурс, а також останні Огляд на LC-MS в Biomarker Відкриття]. Додатково Human Metabolome Database (HMDB)] забезпечує посилання спектра та шляхової інформації, а Metabolomics Workbench[F9s:]