Κατανόηση των Προκλήσεων της Καρτιλαρίας και της Οστικής Πολιτισμού

Τα καρτάλια και οι οστικοί ιστοί παρουσιάζουν μερικά από τα πιο τρομερά εμπόδια στην πρωτογενή κυτταροκαλλιέργεια λόγω των μοναδικών δομικών και βιοχημικών ιδιοτήτων τους. Το καρτίλιο, ιδιαίτερα ο αρθρικός χόνδρος, είναι αγγείο και περιέχει έναν αραιό πληθυσμό χονδροκυττάρων ενσωματωμένα σε μια πυκνή εξωκυτταρική μήτρα (ECM) πλούσια σε κολλαγόνο τύπου ΙΙ, αγκρεκάνη και πρωτεογλυκάνες. Αυτή η μήτρα όχι μόνο αντιστέκεται στην ενζυμική πέψη, αλλά περιορίζει τη διάχυση θρεπτικών συστατικών, καθιστώντας την ανάκτηση των κυττάρων και τον επακόλουθο πολλαπλασιασμό μια σημαντική πρόκληση. Οστός, από την άλλη πλευρά, είναι ένας μεταλλοποιημένος ιστός ιστός αποτελούμενος από υδροξυαπατίτες που εναποτίθενται σε μια κολλαγόνο ικρίωμα. Η παρουσία των όξινου φωσφορικού ασβεστίου απαιτεί αποσβεστική δράση που μπορεί να θέσει σε κίνδυνο τη βιωσιμότητα των κυττάρων αν δεν ελέγχεται προσεκτικά. Επιπλέον, και οι δύο ιστοί εμφανίζουν χαμηλή πυκνότητα κυττάρων (οσφαιρίδια αντιπροσωπεύουν λιγότερο από 5% του όγκου, και τα οστεοκυτίδια είναι εξίσου σπάνια στον κορτικογενή οστό), γεγονός ότι κάθε βιώσιμο κύτταρο ανακτά.

Στρατηγικές για την επιτυχή απομόνωση και τον πολιτισμό κυττάρων

Ενζυμική Διήθηση

Η κολαγενάση (τύποι I, II, ή ένα μείγμα) είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο ένζυμο επειδή διασπά τις εγγενείς ινίδια κολλαγόνου, απελευθερώνοντας εγκλωβισμένα κύτταρα. Για χόνδρο, μια πέψη δύο βημάτων συχνά αποφέρει καλύτερη βιωσιμότητα: πρώτον, μια σύντομη θεραπεία με τρυπσίνη ή προνάση για την απομάκρυνση των προτεογλυκανών επιφανείας, ακολουθούμενη από παρατεταμένη επώαση (4-18 ώρες) με κολλαγόνο σε χαμηλές συγκεντρώσεις (0.1 ⁇ 0.2% w/v).Για τα οστά, ένας συνδυασμός κολλαγόνου και αποβολής (μια ουδέτερη πρωτεάση) χρησιμοποιείται για την πέψη τόσο κολλαγόνου όσο και μη κολλαγόνου πρωτεϊνών. Είναι κρίσιμος για τη βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης ενζύμων και του χρόνου πέψης για κάθε πηγή ιστού. Η υπερβολική δραστηριότητα ενζύμων ή η υπερβολική εκκόλαψη μπορεί να λύσει κύτταρα ή να χωνέψει τους υποδοχείς της επιφάνειας των κυττάρων, μειώνοντας την αποτελεσματικότητα της προσκόλλησης.

Αποκωδικοποίηση ιστού για οστά

Πριν από την ενζυμική πέψη, ο οστικός ιστός πρέπει να αποσβεσθεί για να μαλακώσει τη μήτρα των ορυκτών. Οι δύο κύριες προσεγγίσεις είναι οι χηλικοί παράγοντες (π.χ. EDTA) και τα οξέα (π.χ. υδροχλωρικό ή μυρμηκικό οξύ). Το EDTA σε ουδέτερο pH προτιμάται για μελέτες που απαιτούν υψηλή βιωσιμότητα των κυττάρων, επειδή χηλεύει ιόντα ασβεστίου χωρίς να βλάπτουν κυτταρικές πρωτεΐνες. Τυπικά πρωτόκολλα επωάζουν θραύσματα οστών σε 0,5 M EDTA (pH 7.4) στους 4°C για 24 ⁇ 72 ώρες, αλλάζοντας το διάλυμα καθημερινά. Η αποσβεστικοποίηση με βάση το οξύ είναι ταχύτερη αλλά πιο επιθετική. Συχνά προορίζεται για ιστολογική ανάλυση όπου η βιωσιμότητα των κυττάρων είναι λιγότερο κρίσιμη. Μετά την αποσβεστική, ο μαλακωμένος ιστός ξεπλένεται επιμελώς και στη συνέχεια υποβάλλεται σε επεξεργασία με τυπική ενζυματική πέψη. Οι ερευνητές θα πρέπει να παρακολουθούν το τελικό σημείο με τη δοκιμή της ραδιογραφικής διαφάνειας ή της μηχανικής απαλότητας για την αποφυγή υπερδεκανοποίησης.

Μηχανική Διασύνδεση και Μικροδιάταξη

Για πολύ μικρές βιοψίες ή όταν η ενζυμική πέψη είναι μη πρακτική, μηχανικές μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν. Μικροδιάταξη κάτω από ένα στερεομικροσκόπιο επιτρέπει την ακριβή απομόνωση των ξυρίσματος χόνδρων ή των τραχειοπαθών οστών τσιπ, ελαχιστοποιώντας τη μόλυνση από τους γύρω ιστούς. Επόμενη περικοπή με νυστέρια δημιουργεί μικροσκοπικά εκφυτεύματα που μπορούν να τοποθετηθούν απευθείας σε πιάτα καλλιέργειας (καλλιέργεια των φυτών). Αν και αυτό αποδίδει λιγότερα κύτταρα αρχικά, η ανάπτυξη των κυττάρων από τις άκρες των εκφυτευμάτων μπορεί να είναι σημαντική σε διάστημα 7-14 ημερών. Μηχανική αποσύνδεση μπορεί επίσης να συνδυαστεί με ενζυματικές θεραπείες για τη βελτίωση της αποκατάστασης των κυττάρων, ειδικά από ινοκαρτιάγγι ή χόνδρου πλάκα ανάπτυξης.

Χρήση αυξητικών παραγόντων και Μόριου Σηματοδότησης

Όταν απομονωθούν, τα χονδροκύτταρα και τα οστεοβλάστρια απαιτούν τη συμπλήρωση ειδικού αυξητικού παράγοντα για τον πολλαπλασιασμό και τη διατήρηση του φαινότυπου τους. Οι Μορφογενετικές Πρωτεΐνης των οστών (BMP ⁇ 2, BMP ⁇ 7) και ο Μετασχηματισμός του αυξητικού παράγοντα ⁇ β ⁇ β (TGF ⁇ β, ιδιαίτερα TGF ⁇ β1 και TGF ⁇ β3) είναι απαραίτητες για την προώθηση της χονδρογένεσης και της οστεογένεσης. Ο παράγοντας ανάπτυξης των ινομυβλαστών ⁇ 2 (FGF ⁇ 2) και ο παρόμοιος με την ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας ⁇ Ι (IGF ⁇ I) προστίθενται συχνά για την ενίσχυση των ποσοστών διάδοσης και της επιβράδυνσης της σεληνίασης. Τυπικές συγκεντρώσεις κυμαίνονται από 1 ⁇ 50 ng/ mL, και το χρονοδιάγραμμα των θεμάτων πρόσθεσης· για παράδειγμα, ο TGF ⁇ β συχνά αποσύρεται μετά από την πρώιμη επέκταση για την πρόληψη της υπερτροφίας.

Βελτιστοποίηση των μέσων και των συμπληρωμάτων πολιτισμού

Για τα χονδροκύτταρα, η υψηλή γλυκόζη Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) συμπληρώνεται με GlutaMAX, μη απαραίτητα αμινοξέα, και HEPES ρυθμιστικό διάλυμα είναι κοινή. Osteoblasts ευδοκιμούν σε α ⁇ MEM ή DMEM με μειωμένο ασβέστιο, εάν πρόκειται να προκληθεί αργότερα. συγκέντρωση ορού και συνοχή παρτίδας είναι κρίσιμη? ορισμένα εργαστήρια χρησιμοποιούν 20% ορό για την πρώτη μετάβαση για τη βελτίωση της προσκόλλησης των δειγμάτων χαμηλής απόδοσης. Αντιβιοτικά (penicillin ⁇ streptomycin) και αντιμυκητιασικά (αμφοτερικίνη Β) προστίθενται κατά την αρχική απομόνωση, αλλά θα πρέπει να είναι τεταμένη μόλις οι καλλιέργειες εδραιωθούν για τη μείωση της κυτταροτοξικότητας. Ένας δείκτης pH (φαινόλη ερυθρό) περιλαμβάνεται για οπτική παρακολούθηση, αλλά για ευαίσθητα πειράματα, φαινόλη ⁇ red ⁇ δωρεάν σκευάσματα συνιστάται για την αποφυγή των οιστρογονικών επιδράσεων.

3D Συστήματα Πολιτισμού και Σκαφφάλες

Η μονοστρωματική καλλιέργεια των δύο διαστάσεων μπορεί να προκαλέσει αποδιαφοροποίηση των χοληφόρων (απώλεια κολλαγόνου ΙΙ και έκφρασης της αγκρεκάνης) και επιπεδοποίηση των οστεοβλάστων. Τα τρισδιάστατα συστήματα μιμούνται καλύτερα το φυσικό μικροπεριβάλλον. Οι καλλιέργειες πελλετών (κεντρικά κυτταρικά αδρανή), οι καλλιέργειες μικρομάζας και η ενσαρκώσεις υδρογέλης (αγκινάτη, αλγινικό, κολλαγόνο ή υαλουρονικό οξύ ⁇ με βάση) χρησιμοποιούνται συχνά για τη διατήρηση του φαινότυπου. Οι βιοαντιδραστήρες που εφαρμόζουν κυκλική συμπίεση ή στρες διατμήσεις υγρών ενισχύουν περαιτέρω την παραγωγή μήτρας και την ευθυγράμμιση των κυττάρων. Για τα οστά, τα πορώδη ικριώματα κατασκευασμένα από υδροξυαπατίτη, β ⁇ τρικαλκίου φωσφορικό, ή απομινεράζουσα μήτρα οστού παρέχουν δομική υποστήριξη και οστεοαγωγικές ενδείξεις.

Ποιοτικός έλεγχος και χαρακτηρισμός των απομονωμένων κυττάρων

Μετά την απομόνωση και την καλλιέργεια, είναι επιτακτική ανάγκη να επαληθευτεί η ταυτότητα και η καθαρότητα των κυττάρων. Για τα χονδροκύτταρα, οι θετικοί δείκτες περιλαμβάνουν κολλαγόνο τύπου ΙΙ, αγκρεκάνη, SOX9, και ολιγοχλωρική πρωτεΐνη μήτρας χόνδρου (COMP). Οι δείκτες οστεοβλάστ περιλαμβάνουν Runx2, οστερίξ, αλκαλική φωσφατάση και οστεοκαλκίνη. Η κυτταρομετρία ροής, η ποσοτική PCR και η ανοσοφθορίαση είναι τυποποιημένες μέθοδοι. Η βιωσιμότητα πρέπει να επαναξιολογείται μετά από κάθε πέρασμα. Μια μείωση κάτω από 70% υποδεικνύει στρες. Η καρυοτυποποίηση μπορεί να παρακολουθεί τη χρωμοσωμική σταθερότητα κατά τη διάρκεια παρατεταμένης διαστολής. Επιπλέον, λειτουργικές δοκιμασίες ⁇ όπως η αλκιανή μπλε χρώση για τα πρωτεογλυκανικά σε συσσωματίδια χονδροκυττάρων ή ερυθρό χρώση αλιζαρίνης για καταθέσεις ασβεστίου σε οστεοβλάκτες καλλιέργειες ⁇ επιβεβαιώνουν ότι τα κύτταρα διατηρούν τις εξειδικευμένες λειτουργίες τους.

Συχνές Παγίδες και Αντιμετώπιση προβλημάτων

Η μείωση της απόδοσης των κυττάρων[[LT:1]] μπορεί να αντιμετωπιστεί με την επέκταση του χρόνου πέψης (εντός ασφαλών ορίων), με τη χρήση νωπών ενζύμων ή με συνδυασμό ενζυματικών και εκφυτευτικών μεθόδων. [[LFT:2]Η βακτηριακή ή μυκητιασική μόλυνση[[[LFT:3]] είναι μια συνεχής απειλή, ιδιαίτερα όταν εργάζεστε με χειρουργικά δείγματα· η πλήρης έκπλυση σε αποστειρωμένο PBS που περιέχει 3× αντιβιοτικά πριν από την επεξεργασία μειώνει τους κινδύνους. [[LFT:4]Η διαφοροποίηση [[[LIT:5]] των χονδροκυττάρων συχνά σηματοδοτείται με μια στροφή από την πολυγωνική στην ινοβλαστική μορφολογία· με τη χρήση κυττάρων χαμηλής διέλευσης (P0 ή P1), συνθήκες ορού χωρίς ή χαμηλής πυκνότητας με αυξητικούς παράγοντες, και η καλλιέργεια 3D μπορεί να επιβραδύνει τη διαδικασία αυτή. [FLT6]Poor passification[FLT7] μπορεί να υπερβεί:

Μελλοντικές Οδηγίες και Αναδυόμενες Τεχνολογίες

Οι πρόσφατες εξελίξεις ωθούν τα όρια των όσων μπορούν να επιτευχθούν με σπανίους κυτταρικούς πληθυσμούς από σκελετικούς ιστούς. Η αλληλουχία μονοκυττάρων RNA έχει αποκαλύψει απροσδόκητη ετερογένεια μεταξύ χονδροκυττάρων και οστεοκυτταρωδών, επιτρέποντας πιο στοχευμένες στρατηγικές καλλιέργειας. Τα μοντέλα οργανοειδών και μικρο-ιστών που ενσωματώνουν πολλαπλούς τύπους κυττάρων (χονδροκύτταρα, οστεοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα) αναπτύσσονται για τη μελέτη της οστεοαρθρίτιδας και της επισκευής των οστών. Οι μικρορευτικές πλατφόρμες επιτρέπουν την καλλιέργεια αιμάτωσης των εκφυλασμάτων οστών και χόνδρων, διατηρώντας τη βιωσιμότητα για εβδομάδες. Τα γονιδιακά εργαλεία επεξεργασίας όπως το CRISPR ⁇ Cas9 μπορούν να εισαχθούν στα πρωτογενή κύτταρα για τη μελέτη γονιδιακών λειτουργιών ή σωστών μεταλλάξεων ασθενειών. Επιπλέον, τα προκαλούμενα πνευμονικά βλαστοκύτταρα (iPSCs) κατευθύνονται προς τις χονδρογενείς και οστεογενείς γραμμές, προσφέροντας απεριόριστη πηγή έρευνας και θεραπείας.

Συμπέρασμα

Η προσεκτική επιλογή των ενζυματικών πρωτοκόλλων πέψης, οι μέθοδοι αποσβεστικοποίησης, τα κοκτέιλ αυξητικού παράγοντα και οι πλατφόρμες καλλιέργειας απαιτούν δραματικά βελτίωση της απόδοσης των κυττάρων και φαινοτυπική σταθερότητα. Ο αυστηρός ποιοτικός έλεγχος εξασφαλίζει ότι τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε κατάντη εφαρμογές είναι αυθεντικά και λειτουργικά. Με την υιοθέτηση αυτών των στρατηγικών, οι ερευνητές μπορούν να ξεκλειδώσουν το δυναμικό των σκελετικών κυττάρων μοντέλα για την προώθηση της αναγεννητικής ιατρικής, των δοκιμών φαρμάκων, και της θεμελιώδους κατανόησης των μυοσκελετικών ασθενειών. Συνεχής καινοτομία σε 3D καλλιέργεια, οργανικά ⁇ εν ⁇ α ⁇ τσιπ συστήματα, και τεχνολογία βλαστοκυττάρων θα επεκτείνει περαιτέρω την ικανότητά μας να μελετήσουμε αυτούς τους προκλητικούς αλλά ζωτικούς ιστούς (επανασκόπηση στο Curr. Osteoporos. Rep.).

Για λεπτομερή πρωτόκολλα ενζυμικής πέψης, βλέπε Πρωτόκολλα της φύσης συλλογή· για κατευθυντήριες γραμμές αυξητικών παραγόντων, ανατρέξτε [ Μεταφραστική Ιατρική των βλαστικών κυττάρων· και για τεχνικές αποσβεστικοποίησης, συμβουλευτείτε [PubMed ⁇ indexed methods].