Table of Contents

Αρχές της χρωματογραφίας

Η χρωματογραφία διαχωρίζει τα μόρια με βάση τη διαφορική κατανομή τους μεταξύ σταθερής φάσης και κινητής φάσης. Η σταθερή φάση μπορεί να είναι στερεή ή υγρή επικαλυμμένη σε στερεό υπόθεμα, ενώ η κινητή φάση είναι ένα υγρό ή αέριο που μεταφέρει το δείγμα μέσω του συστήματος. Οι ενώσεις αλληλεπιδρούν με τη σταθερή φάση μέσω , , διαχωρίζοντας[], ανταλλαγή ιόντων[]], ή ] αποκλεισμό μεγέθους [, προκαλώντας τους να εκλείψουν σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. Αυτή η δύναμη διαχωρισμού είναι απαραίτητη για την επίλυση των σύνθετων βιολογικών μητρικών που συναντώνται σε μεταβολικές και βιοδείκτες ανακάλυψης.

Αρκετές παράμετροι επηρεάζουν την απόδοση διαχωρισμού: διαστάσεις στηλών, μέγεθος σωματιδίων, ρυθμός ροής], και σύνθεση φάσης κινητής τηλεφωνίας[]. Σύγχρονα όργανα χρησιμοποιούν υψηλή πίεση για την επίτευξη γρηγορότερων και αποδοτικότερων χωρισμών. Για παράδειγμα, η υπερ-υψηλή απόδοση υγρής χρωματογραφίας (UHPLC) λειτουργεί σε πιέσεις άνω των 15.000 psi, μειώνοντας τους χρόνους λειτουργίας, διατηρώντας παράλληλα υψηλή ανάλυση.

Βασικές τεχνικές χρωματογραφίας για τη μεταβολομολογία

Αέριο χρωματογραφία (GC)

Η GC είναι ιδανική για βολατίλ[] και [] θερμικά σταθερή[ μεταβολίτες. Τα δείγματα εξατμίζονται και διέρχονται μέσω στήλης επικαλυμμένης με υγρή σταθερή φάση, με αδρανές αέριο (π.χ. ήλιο) ως κινητή φάση. Η ιονισμός ηλεκτρονίων (EI) είναι συχνά αναγκαία για να γίνουν πτητικοί πολικοί μεταβολίτες ⁇ τα κοινά αντιδραστήρια περιλαμβάνουν σιλυλιδωτικούς παράγοντες και μεθυλιωτικές ενώσεις. Η GC σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας (GC-MS) παρέχει ] τον ιονισμό ηλεκτρονίων (EI) που είναι υψηλής απόδοσης μέσα από όργανα, επιτρέποντας την ταυτοποίηση με βάση τη βιβλιοθήκη. Αυτό καθιστά την GC-MS μια τυποποιημένη πλατφόρμα για μη στοχευόμενους μεταβολικούς μεταβολίτες όπως τα αμινοξέα, τα λιπαρά οξέα και τα σάκχαρα.

Υγρή χρωματογραφία (LC)

Η LC χειρίζεται μη πτητικές και θερμικά εργαστηριακές [ ενώσεις. Πολλές μελέτες μεταβολομικών χρησιμοποιούν αντιστραφείσα φάση (RP) LC[]] με στήλες C18 για μη πολικά έως μέτριας απόδοσης μόρια, ή υδροφιλική χρωματογραφία αλληλεπίδρασης (HILIC) για εξαιρετικά πολικούς μεταβολίτες. Η Ultra-υψηλή απόδοση υγρής χρωματογραφίας (UHPLC) μειώνει το μέγεθος σωματιδίων κάτω από 2 μm, αυξάνοντας δραματικά την ανάλυση και την ταχύτητα. LC-MS με ηλεκτροσπρέωση (I) είναι το άλογο των σύγχρονων μεταβολικών, καλύπτοντας ένα ευρύ χημικό χώρο.

Ηλεκτροφόρηση τριχοειδών (CE)

Η CE διαχωρίζει τα ιόντα με βάση την ηλεκτροχορητική τους κινητικότητα σε ένα στενό τριχοειδές υπό ηλεκτρικό πεδίο. Είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική για υψηλής πολικότητας] και φορτισμένους μεταβολίτες[], όπως νουκλεοτίδια, οργανικά οξέα και φωσφορυλιωμένες ενώσεις. Το CE-MS προσφέρει εξαιρετική απόδοση διαχωρισμού και χαμηλή κατανάλωση δείγματος, αν και χρησιμοποιείται λιγότερο συχνά από LC ή GC.

Ενσωματώνοντας χρωματογραφία με φασματομετρία μάζας

Οι αμφοτερόπλευρες τεχνικές ⁇ GC-MS, LC-MS, CE-MS ⁇ είναι η σπονδυλική στήλη των μεταβολομικών. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός μειώνει την καταστολή των ιόντων και επιτρέπει στα φασματόμετρα μάζας να αναλύουν μεμονωμένα τις ενώσεις. Η φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης (HRMS) (π.χ., Q-TOF, Orbitrap) παρέχει ακριβείς μετρήσεις μάζας για την ταυτοποίηση των μεσίτων με αυτοπεποίθηση. Η φασματομετρία μάζας του ταλέντος (MS/MS) αποδίδει δομικές πληροφορίες μέσω των προτύπων κατακερματισμού. Οι τρόποι απόκτησης δεδομένων περιλαμβάνουν την πλήρη ανίχνευση για την αστόχη προφιλογράφηση και την παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων (MRM)[FLT7]] για την ποσοτική ανάλυση γνωστών βιοδειγμάτων.

Η ροή εργασίας των μεταβολομικών

Προετοιμασία δείγματος

Το κατάλληλο παρασκεύασμα δείγματος είναι κρίσιμο. Τα μεταβολίτες αναποδογυρίζονται γρήγορα, οπότε ο μεταβολισμός πρέπει να να είναι [ τεταμένη [[[g., χλωροφόρμιο/νερό]] χωριστά πολικά και μη πολικά κλάσματα]. Παραγωγή ] για GC-MS ή Η καθίζηση πρωτεΐνης[[LFT:7]] για LC-MS είναι κοινά βήματα. Τα εσωτερικά πρότυπα προστίθενται για διόρθωση των μητρικών επιδράσεων και της μετατόπισης οργάνων.

Διαχωρισμός και ανίχνευση

Οι συνθήκες χρωματογραφίας βελτιστοποιούνται ανάλογα με τις κατηγορίες του μεταβολίτη που παρουσιάζουν ενδιαφέρον. Για παράδειγμα, μια στήλη C18 με κλίση νερού/ακετονιτρίλιο και 0,1% μυρμηκικό οξύ ταιριάζει περισσότερο λιπιδομική. Οι στήλες HILIC χρησιμοποιούν υψηλές οργανικές φάσεις περιεχομένου κινητών για πολικούς μεταβολίτες. Η θερμοκρασία της στήλης, ο ρυθμός ροής και ο όγκος της ένεσης ρυθμίζονται ώστε να μεγιστοποιείται η μέγιστη χωρητικότητα και αναπαραγωγιμότητα.

Επεξεργασία δεδομένων

Τα δεδομένα φασματομετρίας ακατέργαστης χρωματογραφίας-μάζας υποβάλλονται []ανίχνευση αιχμής[, ευθυγράμμιση[] σε δείγματα και κανονικοποίηση[]] (π.χ., σε συνολικό αριθμό ιόντων ή σε εσωτερικό πρότυπο). Εργαλεία όπως XCMS, MZmine και Compound Discoverer αυτοματοποιούν αυτά τα βήματα. ⁇ Στατιστική ανάλυση] ⁇ κύρια ανάλυση συστατικών στοιχείων (PCA), μερική ανάλυση μερικών ελαχίστων τετραγωνικών-διακριτικών (PLS-DA) ⁇ προσδιορίζει μεταβολίτες που διαφέρουν μεταξύ ομάδων. Αναγγελία] χρησιμοποιεί βάσεις δεδομένων όπως HMDB, METLIN, NISTIN και NIST.

Προσεγγίσεις Μεταβολομικής

Μη στοχευόμενα μεταβολομικά

Η μη στοχευόμενη μεταβολομική έχει ως στόχο να ανιχνεύσει όσο το δυνατόν περισσότερους μεταβολίτες χωρίς προηγούμενη γνώση. Η σφαιρική περιγραφή δημιουργεί υποθέσεις σχετικά με μεταβολικές διαταραχές. Η χρωματογραφία πρέπει να είναι ευρεία ή πολλαπλές στήλες που χρησιμοποιούνται. Για παράδειγμα, μια προσέγγιση διπλής στήλης (RP-LC και HILIC) καλύπτει τόσο πολικές όσο και μη πολικές ενώσεις. Τα μη στοχευόμενα δεδομένα είναι ημιποσοτικά και απαιτούν προσεκτική επικύρωση.

Στοχευμένα Μεταβολομικά

Η στοχευμένη μεταβολομιμητική επικεντρώνεται στην ποσοτικοποίηση ενός προκαθορισμένου συνόλου μεταβολιτών, συχνά βιοδείκτες. [[LFT:0]]Τα σταθερά ισότοπα εσωτερικά πρότυπα[[LFT:1]] επιτρέπουν τον απόλυτο ποσοτικό προσδιορισμό. Η MRM σε τριπλά όργανα τετραπορίου παρέχει υψηλή ευαισθησία και εξειδίκευση. Η χρωματογραφία βελτιστοποιείται για τις ενώσεις-στόχους, συχνά με μικρότερο χρόνο λειτουργίας για υψηλή απόδοση.

Ρόλος της χρωματογραφίας στην ανακάλυψη Biomarker

Φάση ανακάλυψης

Στην ανακάλυψη βιοδείκτη, η χρωματογραφία διαχωρίζει τα σύνθετα βιολογικά υγρά (πλάσμα, ούρα, εκχυλίσματα ιστού) για να αποκαλύψει μεταβολίτες που συσχετίζονται με την ασθένεια. Για παράδειγμα, τα αμινοξέα διακλαδισμένης αλυσίδας (BCA) αναγνωρίστηκαν ως πρώιμοι δείκτες αντοχής στην ινσουλίνη χρησιμοποιώντας LC-MS. Αστόχαστες μελέτες συγκρίνουν τις ομάδες, και εκατοντάδες υποψήφια χαρακτηριστικά μειώνονται σε μερικές δεκάδες μέσω στατιστικών φιλτραρίσματος.

Φάση επικύρωσης

Η χρωματογραφία παρέχει την αναπαραγωγιμότητα[ που απαιτείται για την επικύρωση. Η σταθερότητα του χρόνου διατήρησης και η ακρίβεια μάζας εξασφαλίζουν συνεπή ταυτοποίηση. Η μέθοδος επικύρωσης περιλαμβάνει την αξιολόγηση της γραμμικότητας, των ορίων ανίχνευσης, της ακρίβειας και της ακρίβειας.

Κλινική Μετάφραση

Η μετάβαση από την έρευνα σε κλινικά διαγνωστικά απαιτεί ισχυρές, υψηλής απόδοσης μεθόδους. Χρωματογραφικές δοκιμασίες για βιοδείκτες όπως [[LFT:0]]]Homocysteine (LC-MS/MS) και Μεταβολίτες βιταμίνης D[[LFT:3] (LC-MS) χρησιμοποιούνται ήδη σε κλινικά εργαστήρια. Ο αυτοματισμός (π.χ., σε απευθείας σύνδεση SPE σε συνδυασμό με LC-MS) μειώνει τον χειρισμό και την αύξηση της ροής.

Μελέτες Περιπτώσεων σε Βιοδείκτες Νόσων

Μεταβολικές ουσίες του καρκίνου

Τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν μεταβαλλόμενο μεταβολισμό ⁇ το φαινόμενο του πολέμου (αερόβια γλυκολύση).Η χρωματογραφία επέτρεψε την ανακάλυψη αυξημένων γαλακτικών, τροποποιημένων ενδιάμεσων κύκλων TCA και αλλαγών στο μεταβολισμό των νουκλεοτιδίων. Για παράδειγμα, ]2-υδροξυγλουταρικών είναι ένας ογκομεταβολίτης σε γλοιώματα του κύκλου IDH, που ανιχνεύονται από GC-MS. Λιπιδομικά χρησιμοποιώντας LC-MS έχει αποκαλύψει μεταβαλλόμενα προφίλ φωσφολιπιδίων σε καρκίνους μαστού και προστάτη.

Διαβήτης και Μεταβολικό Σύνδρομο

Το μεταβολικό σύνδρομο περιλαμβάνει δυσρυθμίσεις λιπιδίων, αμινοξέων και γλυκόζης. Μελέτες χρωματογραφίας έχουν εντοπίσει BCAAs, αρωματικά αμινοξέα (τυροσίνη, φαινυλαλανίνη) και ακρυλοκαρνιτίνες ως προγνωστικά διαβήτη τύπου 2. Η προφιλτρίωση των κεραμιδίων και των διακυλυκερολών συνδέει τον μεταβολισμό των λιπιδίων με την αντίσταση στην ινσουλίνη.

Νευροεκφυλιστικές ασθένειες

Η Αλτσχάιμερ, το Parkinson και το ALS περιλαμβάνουν μεταβολική δυσλειτουργία στον εγκέφαλο και την περιφέρεια. Λιπιντομικά χρησιμοποιώντας LC-MS αποκαλύπτονται μεταβολές στα σφιγγολιπίδια και τις στερόλες στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Τα επίπεδα πολυαμίνης[[LFT:3]] (σπερμιδίνη, στερεσίνη) τροποποιούνται στα Αλτσχάιμερ, που ανιχνεύονται από το HILIC-MS. Οι χρωματογραφικές μέθοδοι βοηθούν στον εντοπισμό υπογραφών μεταβολίτη που συσχετίζονται με τη γνωστική παρακμή.

Προκλήσεις και Λύσεις

Επιδράσεις Matrix και Καταστολή Ιόντων

Οι ενώσεις συν-εξώθησης μπορούν να καταστείλουν τον ιονισμό στο MS. Καλύτερη χρωματογραφική ανάλυση μειώνει τη συν-εξώθηση. Χρησιμοποιώντας τα εσωτερικά πρότυπα με ισοτοπική σήμανση[ αντισταθμίζει τα αποτελέσματα μήτρας.

Αναπαραγωγιμότητα δεδομένων

Η μεταβλητότητα μεταξύ των ράβδων παραμένει εμπόδιο. Κάθε μοντέλο (π.χ. με χρήση NIST SRM 1950) βελτιώνει την αναπαραγωγιμότητα. Η σύγκριση του χρόνου διατήρησης με αλκυλαμίνες ή άλλα διακριβωτικά βοηθά στην ευθυγράμμιση των δεδομένων σε όλες τις διαδρομές.

Μελέτες μεγάλης κλίμακας

Η μεταγλωτομική σε επίπεδο πληθυσμού απαιτεί χειρισμό χιλιάδων δειγμάτων. Αυτοματοποιημένη προετοιμασία δείγματος[ (ρομποτικά) και U(H)PLC με σύντομες στήλες[ (π.χ., 5 λεπτά κλίσεις) επιτρέπουν την υψηλή διείσδυση. Διόρθωση πακέτων[] αλγορίθμων (π.χ., διόρθωση QC) απόκλιση διεύθυνσης σε μεγάλες ακολουθίες.

Μελλοντική προοπτική

Διαχωρισμοί υψηλής ανάλυσης

Οι πρόοδοι στην τεχνολογία στήλης (π.χ., ]υπο-2 μm σωματιδίων πυρήνα-οχύλι) και φασματομετρία κινητικότητας ιόντων (IMS) προσθέτουν διάσταση διαχωρισμού με βάση την εγκάρσια τομή σύγκρουσης [LC-IMS-MS[] μπορούν να επιλύσουν ισομερή και να αυξήσουν την ικανότητα αιχμής. Κατανοητική δισδιάστατη GC (GC×GC) αποκτά έλξη για πτητικά μεταβολομικά.

Αυτοματισμός και μικροβιοποίηση

Οι μικρορευστικές συσκευές και τα ψηφιακά μικρορευστικά αναπτύσσονται για προετοιμασία και διαχωρισμό δειγμάτων επί του μικροεπεξεργαστή. Τα συστήματα που είναι ενσωματωμένα στο σύστημα SPE-LC-MS μειώνουν τα χειροκίνητα βήματα, αυξάνοντας την αναπαραγωγιμότητα.

Ολοκλήρωση με την Μάθηση Μηχανικών

Οι αλγόριθμοι μηχανικής μάθησης προβλέπουν χρόνους κατακράτησης, βοήθεια στη σημείωση των μεταβολιτών από τα MS/MS phactra, και προσδιορίζουν μοτίβα σε μεγάλα σύνολα δεδομένων. Συνδυάζοντας τα δεδομένα κατακράτησης χρωματογραφίας με φασματικές πληροφορίες μάζας βελτιώνει την εμπιστοσύνη στην ταυτοποίηση βιοδείκτη. Βαθιά μάθηση μοντέλα μπορούν επίσης να προτείνουν βέλτιστες συνθήκες διαχωρισμού.

Συμπέρασμα

Η χρωματογραφία παραμένει απαραίτητο εργαλείο για την ανακάλυψη μεταγλωτολόγων και βιοδείκτη. Από το διαχωρισμό χιλιάδων μεταβολιτών σε επικυρωτές κλινικών βιοδείκτες, οι χρωματογραφικές τεχνικές παρέχουν την ανάλυση, την αναπαραγωγιμότητα και την ποσοτική ακρίβεια που απαιτείται. Καθώς τα όργανα εξελίσσονται ⁇ με υψηλότερες πιέσεις, καλύτερες χημικές στήλες, και η ολοκλήρωση με την κινητικότητα ιόντων και αυτοματισμού ⁇ η χρωματογραφία θα συνεχίσει να οδηγεί την πρόοδο στην ιατρική ακριβείας και μεταβολική φαινοτυπία. Οι ερευνητές θα πρέπει να εξετάσουν τα δυνατά σημεία κάθε τεχνικής (GC, LC, CE) και τις ροές εργασίας σχεδιασμού που μεγιστοποιούν την κάλυψη του μεταβολώματος, διατηρώντας παράλληλα την ποιότητα των δεδομένων.

Για περαιτέρω ανάγνωση, βλέπε ] Σελίδα θέματος Φυσικής Μεταβολομικής, Χρωματογραφία Online πόρων, και πρόσφατη ανασκόπηση LC-MS στην ανακάλυψη βιοδείκτη[]. Επιπλέον, η Βάση δεδομένων για το ανθρώπινο μεταβολιμό (HMDB) παρέχει φάσματα αναφοράς και πληροφορίες για το μονοπάτι, και το Μεταγλογονόμηση εργασίας προσφέρει δημόσια σύνολα δεδομένων και εργαλεία ανάλυσης.