تحقیقات ژنتیکی مدرن به یک دوره تحول یافته است که توسط توسعه ابزارهای دقیق ویرایش ژن هدایت شده است.در میان فن آوری های پیشگام، TALENs (Tralection Activeor-Like Effector Nucleases) و ZFNs (Zinc Finger Nuenoeases) به عنوان سیستم عامل های بنیادی که اصلاح DNA هدفمند را مدتها قبل از انقلاب مهندسی شده به این دانشمندان اجازه می دهد تا به نقاط هدف (وجه زدن) برسند.

درک مکانیسم های TALENs و ZFNs

انگشت روی Nucleases: تشخیص DNA استاندارد

ZFNs اولین بار به طور گسترده ای پذیرفته شده بود nucleases، که برای اولین بار در اواسط دهه 1990 شرح داده شد، هر ZFN شامل یک دامنه DNA-binding از پروتئین های انگشت روی و یک دامنه DNA که به طور قابل توجهی از ZLT:0FokI [LT:1] محدودیت نهایی است، معمولاً باید یک ماژول های پایه را با هم پیوند دهد.

طراحی و مونتاژ آرایه های انگشت روی می تواند به دلیل وابستگی های وابسته به متن چالش برانگیز باشد – تشخیص انگشت روی می تواند تحت تاثیر انگشتان مجاور قرار گیرد، روش هایی مانند باز کردن ( مهندسی وابسته به استخر) و مونتاژ بافت، پیش بینی پذیری را بهبود داده اند. ZFNs برای ایجاد خطوط سلول های سلول های ضربه زدن، تولید مدل های حیوانی، و اصلاح بیماری در مراحل اولیه در جهش های بالینی استفاده شده است.

فعال سازی مانند اثربر نوکلمات: ویژگی های تک-Nucleotide

TALENs در اطراف 2009-2010 به عنوان یک جایگزین با قوانین طراحی ساده تر ظهور کرد. [] دامنه DNA-binding از اثرهای شبیه رونویسی (TALEs)، پروتئین های مخفی شده توسط پاتوژن گیاهی (FLT:0Xanthomonas هر ماژول TALE دقیقا یک nucleotide را تشخیص می دهد، که توسط دو متغیر اسید سمی (xdable) مشخص شده است.

TALEN ها همچنین از FokI دامنه دایره ای استفاده می کنند و نیاز به اتصال جفت برای برش دارند. مونتاژ آرایه های تکرار TALE می تواند با استفاده از صخره های طلایی یا سنتز فاز جامد به دست آید. TALEN ها به طور کلی ویژگی های بالاتری نسبت به ZFNs و سمیت پایین تر در سلول ها نشان می دهند، اگرچه اندازه بزرگ (cx3) می تواند برای تزریق یک ژن تزریقی استفاده شود.

توسعه تاریخی و Milestones

سفر nucleases مهندسی شده با کشف پروتئین های انگشت روی ([۳] در اواخر دهه ۱۹۸۰، چاندراهاگ و همکارانش یک دامنه سه-زینک را برای (FLT:۰FokI[F5] تزریق کردند، و اولین ZFN را نشان دادند که ویرایش ژن هدفمند در سلول های آزمایشی (F:2) را فعال کرد.[۳][۳][۳][۳][۳][۳][۳][۳][۳][۳][۳][۳][۳][۲][۲][۲][۲][۲][۳][۳][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲][۲

تکنولوژی TALEN به سرعت پس از کاهش ساختاری پروتئین های TALE در سال 2007 توسعه یافت، در عرض سه سال، چندین گروه TALEN های عملکردی را برای ویرایش ژن در مخمر، گیاهان و سلول های انسانی گزارش کردند. سادگی آنها مانع برای ویرایش ژنوم را کاهش داد، جرقه موجی از کشف.در 2012، TALEN ها برای ایجاد اولین بررسی ژن کیم برای ژن سازی و ژن سازی موازی استفاده شدند.

برنامه های کاربردی در تحقیقات مدرن

تحقیقات پزشکی و ژن درمانی

ZFNs و TALENs ژن درمانی پیشرفته برای اختلالات تکوژنیک (LT1) در بیماری سلول های سلول های اگزوز و بتاthalassemia، ZFNs هدف قرار دادن ]BCL11A [FLT1] را بهبود داده اند که نشان می دهد که مولکول های ضد میکروبی بهبود یافته اند.

بیوتکنولوژی کشاورزی

در بهبود محصول، TALEN ها و ZFNs برای ایجاد انواع مقاوم در برابر علف کش و بیماری استفاده شده اند. اولین محصول اصلاح شده TALEN-edited - یک دانه با بهبود یافته روغن - توسط CaLTLTxt توسعه یافته و در سال 2019 منتشر شده است. ZFNs برای افزایش پذیرش برنج توسط از بین بردن اندازه های منفی از مواد تشکیل شده است.

ژنومیک های عملکردی و ارگانیزم های مدل

هر دو سیستم عامل مطالعات سیستماتیک در گونه هایی که سلول های بنیادی جنینی در آن ها وجود نداشت را فعال کرده اند.در zebrafish، TALENs برای ایجاد >200 جهش یافته های هدفمند در یک تلاش کنسرسیوم منفرد، نشان دادن عملکرد ژن در توسعه و بیماری، ZFNs اختلال در سیستم های ویرایش بافتی خاص (FLT:0p53 تومور سرکوب کننده همچنین برای ایجاد مدل های بیان خاص و ویروس های HDR را با استفاده از طریق استفاده از جهش های دقیق از طریق جهش های HDR گسترش داده است.

قدرت ها و محدودیت ها در مقایسه با CRISPR-Cas9

ظهور CRISPR-Cas9 (2012) ارائه طراحی ساده تر، قابلیت چند برابر کردن و بهره وری بالاتر، منجر به تصویب گسترده آن، با این حال، TALENs و ZFNs حفظ مزایای منحصر به فرد است، تشخیص DNA مبتنی بر پروتئین خود را به RNA راهنما، از بین بردن خطر از RNA واسطه اثرات هدف، علاوه بر ZFNs و TALEN نشان می دهد که اندازه خاص از توالی دوگانه (AA).

محدودیت عمده هزینه و کار مورد نیاز برای مهندسی ZFNs جدید یا TLT 2 برای هر هدف است، در حالی که کریسپر نیاز به طراحی مجدد از یک توالی راهنمای 20-bp، ZFN و TALEN سنتز پارامتری از پروفایل های پیوند پروتئین و اعتبار آفلاین نیز یک نگرانی است؛ آرایه های انگشت می تواند ناسازگاری را تحمل کند و (تجزیه سازی دقیق در سایت های هدف یا تجزیه و تحلیل دقیق).

مسیر های آینده و پیشرفت های مداوم

هدف فعلی تحقیقات افزایش بهره وری و ایمنی TALEN ها و ZFNs در حالی که کاهش هزینه های تولید.پیشرفت در مهندسی پروتئین ZFNs با بهبود ترماست پذیری و کاهش سنتز روزانه هدایت شده از طریق طراحی مجدد از اهداف ساخت و ساز منحصر به فرد (FLT:1) انواع (مانند ELDK-KRK) و کم سازی دقیق، و بهینه سازی دقیق برای سیستم های Tput.

تحویل همچنان یک تنگنا برای برنامه های کاربردی زنده است. نانوذرات لیپی و بردارهای ویروسی مرتبط با آنتیeno برای سلولهای بنیادی هیماتپویاتیک و hepatocytes تصفیه شده اند. تحویل گذرا پروتئین های ZFN / TAL (به جای DNA) کاهش طولانی مدت بیان و رویدادهای هدف گذاری شده در کشاورزی، TALEN تایید شده است که به نفع تمام محصولات نظارتی طبیعی آنها است.

در نهایت، ترکیب TALEN ها یا ZFN ها با ویرایش پایه ( یا ویرایش اول) - تکنولوژی هایی که به جای دو رشته ای و دو رشته ای به کار می روند، می توانند ابزار خود را گسترش دهند؛ به عنوان مثال، یک ویرایش cytidine deaminase می تواند بدون وقفه های دو رشته ای و دو گانه، تبدیل هدف را انجام دهد.

در نتیجه، TALEN ها و ZFN ها در جعبه ابزار تحقیقاتی ژنتیکی حیاتی باقی می مانند، خواص متمایز آنها - تشخیص DNA، ویژگی های بالا و ایمنی ثابت - آنها را برای برنامه های خاص غیر قابل جایگزینی می سازد، به ویژه هنگامی که ابزارهای مبتنی بر RNA نامناسب هستند، زیرا زمینه به سمت پزشکی دقیق و کشاورزی پایدار حرکت می کند، این پیشگامانه nuclease به گربه ها ادامه می دهد تا اکتشافات سلامت و امنیت غذایی را بهبود بخشد.