Superkriittinen nestekromatografia (SFC) on kehittynyt tehokkaaksi ja monipuoliseksi analyysitekniikaksi analyyttisessä kemiassa, erityisesti monimutkaisten lipidien ja rasvahappojen analysoinnissa. Viime vuosikymmenen aikana instrumentointi-, kolonnitekniikka- ja havaitseminen-innovaatiot ovat liikuttaneet SFC:tä kapeasta menetelmästä valtavirtaan lipidomiikka-, elintarvikkeiden laadunhallinta- ja biolääketieteellisen luonteenpiirteen. Sen kyky erottaa haihtumattomia, lämpölabileja ja rakenteellisesti erilaisia lipidilajeja, joiden nopeuden ja alhaisen liuottimen kulutus on tehnyt siitä houkuttelevan vaihtoehdon kaasukromatografialle (GC) ja nestekromatografialle (LC). Tässä artikkelissa tarkastellaan keskeisiä periaatteita, viimeaikaisia teknologisia läpimurtoja, käytännön sovelluksia ja tulevia SFC:n ohjeita rasva- ja rasvahappoanalyysissä.

Ylikriittisen nestekromatografian perusteet

SFC käyttää ylikriittistä nestettä (CO]2[]) . Mobiilivaihe. Yli kriittisen lämpötilan (31,1 °C) ja paineen (73,8 bar), CO[[2[] tulee tilaan, jossa se esiintyy kaasumaisen viskositeetin ja diffuusiokyvyn yhdistelmässä nestemäisen erotusvoiman kanssa. Tämä ainutlaatuinen yhdistelmä mahdollistaa nopean massansiirron ja analyytin tehokkaan erottamisen erilaisilla polaarisilla ominaisuuksilla. Ylikriittisen CO[2[]:n lujuus voidaan yleisesti käyttää polaaristen lipidien muuttujien määrittämiseen. Modifiergradientit käytetään eluutereihin, mukaan lukien fosfolipidit ja sphingolipidit. Modifier-järjestelmät toimivat paineissa 600 °C:n paineissa ja lämpötiloissa.

Viimeaikaiset teknologiset edistysaskeleet

Korkearesoluutioinen massaspektrometria (HRMS) Kytkentä

SFC:n kytkeminen korkean resoluution massaspektrometriaan.Neljäsosa-aika-lento (Q-TOF) ja Orbitrap-instrumentti ovat mullistaneet lipidiprofiloinnin. HRMS:n avulla saadaan aikaan tarkat massamittaukset ([[<1 ppm) that enable confident identification of lipid species and their regioisomers. For example, SFC‑MS/MS workflows can distinguish between ]sn[]]-1 ja []n[[]-2 rasvahappoa triasyyliglyserolien osalta, mikä on kriittinen tarve ravitsemuksellisissa ja metabolisissa tutkimuksissa. Viimeaikaiset tutkimustulokset [] osoittavat yli 400 lipidilajia 15 luokasta alle 30 minuutissa.

Edistyneet Stationaariset vaiheet ja kolonnakemia

Kolumnin teknologia on kehittynyt merkittävästi monimutkaisten lipidiseosten erottamiseen. Tavanomaisen paljas silika- tai C18-faasin lisäksi on tehty tiivistevaiheita, joissa on räätälöity valikoivuus rasvaluokan erottamiseen. Esimerkiksi 2-etyylipyridiini (2-EP), dioli- ja propyylisyaanifaasit tarjoavat ortogonaalisen selektiivisyyden fosfolipideille, glykolipideille ja neutraaleille lipideille. Ala-2-μm:n huokoiset hiukkaset ja pintahuokoiset (ydinkuori) hiukkaset tarjoavat korkean hyötysuhteen säilyttäen kuitenkin kohtuullisen vastapaineen. Huomattava innovaatio on ]ultra-suorituskykykongressikromatografian (UPC2) [[], joka käyttää sub-2-μm:n hiukkasia ja toimii ultra-suurilla paineilla saavuttaakseen UHPLC:n kaltaiset erotusnopeuksia.

Automaatio ja korkeatehoiset alustat

Nykyaikaisiin SFC-järjestelmiin kuuluu auto-ottimet, jotka pystyvät käsittelemään monia näytteitä, tarkkoja vastapainesäätimiä (BPR) ja kolonnin kytkentäventtiilejä multipleksoitua analyysiä varten. Nämä ominaisuudet mahdollistavat suuren läpiviennin työnkulun, joka on välttämätöntä suurimittaisille kohorttitutkimuksille tai rutiininomaiselle laadunvalvonnalle. Miniaturoidut SFC-järjestelmät, joita joskus kutsutaan kapillaari- tai mikrosfääriksi, vähentävät liuotinkulutusta mikrolittereihin per ajo ja mahdollistavat kytkennän nano-ESI-MS:ään herkkyyden parantamiseksi. Automatisoitu menetelmäkehitysohjelmisto, joka optimoi nopeasti muuntimen kaltevuuden, lämpötilan ja paineen, on nyt integroitu kaupallisiin alustoihin lyhentämällä menetelmää päivistä tuntiin.

Rasva- ja rasvahappoanalyysin sovellukset

Lipidomics ja biomarkkerin löytö

SFC-MS on erinomainen tässä, koska se voi erottaa lipidit laajasta polaarisuusalueesta yhdellä kerralla. Maamerkkitutkimuksessa Bamba [[]et al.[[[]]] in []]Analyyttinen kemia[]]] käytetään SFC-MS profiloimaan lipidejä nisäkässseerumin, kattaa vapaat rasvahapot, fosfolipidit ja triasyyliglyseridit korkealla uusittavuus. Tekniikkaa käytetään nyt löytämään lipidien biomarkkereita tyypin 2 diabeteksen, ei-alkoholipitoisen rasvamaksan (NAFLD) ja tiettyjen syöpäsairauksien osalta. Esimerkiksi muuttunut lysofosfatidyylikoliini ja ceramidiprofiileja plasmasta, jolla on varhaisen vaiheen koloekaalisyöpä, käyttäen SFC-MS-töitä.

Elintarvikkeiden laadun ja aitouden valvonta

Rasvahappokoostumus on ravintoöljyjen, maitotuotteiden ja jalostettujen elintarvikkeiden ravintoarvon ja säilyvyyden keskeinen tekijä. SFC tarjoaa nopeamman analyysin rasvahappometyyliestereistä (FAME) perinteisiin GC-menetelmiin verrattuna, ja sen kestoajat ovat usein alle 10 minuuttia. Lisäksi SFC voi analysoida suoraan vapaita rasvahappoja ja asyyliglyseroleja ilman derivaation, yksinkertaistamalla näytteen valmistelua. Äskettäin tehty työ SFC-UV-valmisteen avulla voidaan määrittää omega-3 ja omega-6 rasvahappoja kalaöljykapseleissa, jolloin suhteellisen standardipoikkeaman arvo on alle 2 prosenttia. Tekniikkaa käytetään myös kalliiden öljyjen (esim. oliiviöljyn) väärentämisen havaitsemiseen profiloimalla ehjän triasyyliglyserolisormen.

Kliiniset ja diagnostiset sovellukset

Kliinisissä laboratorioissa SFC on saamassa vetoa rasvahappojen ja lipidien kvantifioimiseksi, kun on kyse synnynnäisistä aineenvaihduntavirheistä ja sydän- ja verisuoniriskistä. Plasman vapaan rasvahappoprofiilin (FFA) mittaamiseksi mitataan insuliiniresistenssin ja diabeettisten komplikaatioiden arvioimiseksi. SFC-MS sallii samanaikaisesti FFA:n, hydroksi- ja oksilipiinien, jotka ovat bioaktiivisia lipidien sovittimia. []artikkeli ]Talanta[]]]:ssa ilmoitti 20 oksilipiinin SFC-MS/MS-menetelmän samanaikaisen määrittämisen ihmisen plasmassa ja sen havaitsemisrajan ollessa alle 0,1 ng/ml, mikä mahdollistaa vankan määrityksen kliinisissä tutkimuksissa.

Rasva-aineenvaihdunta ja kasvibiokemia

Biosynteesin ymmärtäminen kasveissa, levässä ja mikro-organismeissa on tärkeää biopolttoaineiden tuotannossa ja ravitsemuksellisessa parantamisessa. SFC-MS mahdollistaa kalvon lipidien, varastointilipidien ja niiden esiasteiden nopean analysoinnin. Tutkijat ovat käyttäneet SFC:tä mikrolevän glyseroglykolipidien ja fosfolipidien profiloimiseen erilaisissa kasvuolosuhteissa, mikä paljastaa, miten ravinnerasitus muuttaa lipidien kertymistä.

Vertailu perinteisiin menetelmiin

Verrattuna kaasukromatografiaan (GC), SFC välttää haihtumattomien lipidien johtamisen tarpeen, säilyttää lämpölabiilit yhdisteet (esim. monityydyttymättömät rasvahapot, joilla on monia kaksoissidoksia, hapetetut lipidit), ja käyttää alhaisempia käyttölämpötiloja. GC tarjoaa kuitenkin erinomaisen erottelukyvyn yksinkertaisille FAMEille ja pysyy vertailumenetelmänä rasvahappokoostumuksen suhteen monissa sääntely-olosuhteissa. SFC voi toisaalta analysoida ehjiä triasyyliglyseroleja ja polaarisia lipidejä, jotka eivät ole GC:n ulottuvilla.

Suhteessa nestekromatografiaan (LC, erityisesti käänteisfaasi), SFC tarjoaa nopeampia analyysiaikoja (tyypillisesti 5.15 minuuttia vs. 20.60 minuuttia lipidomiikkajuoksujen osalta), käyttää vähemmän orgaanista liuotinta ja usein antaa parempia huippumuotoja lipideille, jotka pyrkivät häntään LC:ssä. Poikkeama on se, että polaarilipidit, kuten voimakkaasti happamat fosfolipidit, saattavat vaatia suuria modifioivia prosenttiosuuksia, jotka vähentävät liikkuvan vaiheen ylikriittistä luonnetta ja osittain vähentävät SFC. Kuitenkin sarakkeen kemian viimeaikaiset kehitys on lieventänyt tätä rajoitusta.

Metodien kehittämisen haasteet ja näkökohdat

Vahvuudestaan huolimatta SFC rasva-analyysiin on tiettyjä haasteita. Hyvin lipofiilisten yhdisteiden liukoisuus ylikriittiseen CO2:een voi olla vähäistä; lisäaineita, kuten ammoniumasetaattia tai muurahaishappoa tarvitaan usein huippumuodon parantamiseen ja ionisaatioon MS:ssä. Saranan valinta on kriittinen.Korkeasti valitut vaiheet voivat johtaa lipidien yhteiselutukseen. Menetelmän siirto välineiden välillä voi olla vaikeaa BPR-suunnittelun ja kuolleiden tilavuuden erojen vuoksi. Pitoajan standardointi laboratorioissa on edelleen viivettä LC:n ja GC:n jälkeen, vaikka tuoreiden laboratorioiden välisten tutkimusten mukaan tätä on alettu käsitellä. Lopuksi korkean paineen pumppujärjestelmien kustannukset ja erityiskoulutuksen tarve saattavat estää adoption pienemmissä analyysilaboratorioissa.

Tulevat näkymät

Seuraavassa aallossa SFC-analyysissä innovaatiot keskittyvät todennäköisesti useisiin aloihin. Ensinnäkin ionin liikkuvuusspektrometrin (IMS) ja SFC-MS:n yhdistäminen lisää törmäyskuoppaan perustuvan erottelun lisäulottuvuutta, mikä mahdollistaa kromatografiseen ulottuvuuteen liittyvien isomeeristen lipidien resoluution. Toiseksi avoimen putki- (kapilarina) SFC-kolonnien sisähalkaisija on 25.50 μm, ja ne voivat luvata vielä nopeampia erotteluja ja pienempi näytekulutus. Kolmanneksi kannettavien tai kenttäkäyttökelpoisten SFC-järjestelmien kehittäminen kryogeenisen CO2-sukupolven avulla voi nopeuttaa lipiditestausta ja lisätä elintarvikkeiden tuotantoa. Neljänneksi säilytysaikatietokantojen ja kone- ja oppimislähtöisen menetelmän optimointi yksinkertaistaa menetelmän kehittämistä ei-laajentuville käyttäjille.

Päätelmä

Superkriittinen nestekromatografia on kehittynyt vahvaksi, suorituskykyiseksi työkaluksi rasva- ja rasvahappojen analysointiin. Viimeaikaiset edistysaskeleet ilmaisinherkkyydessä, kolonnien valikoivuudessa ja automaatiossa ovat avanneet sovelluksia, jotka vaihtelevat kliinisistä biomarkkereista elintarvikkeiden aitouteen. Vaikka haasteita on edelleen instrumenttien standardoinnissa ja menetelmien siirtämisessä, uusien kiinteiden vaiheiden, pallomaisten tekniikoiden ja pienoismallien jatkuva kehittäminen viittaa lupaavaan tulevaisuuteen. Koska kysyntä nopeammin, vihreämmin ja informatiivisemmin rasva-analyysi kasvaa, SFC on hyvässä asemassa täydentämään .