Viimeaikaiset edistysaskeleet genomialalla ovat laajentaneet syvällisesti ymmärrystämme siitä, miten geneettinen vaihtelu ajaa terveyttä, sairauksia ja lääkevastetta. Ihmisen genomivarastot miljoonia muunnelmia, mutta suurin osa niistä on edelleen määrittelemätön niiden toiminnallisten seurausten kannalta. Perinteiset menetelmät yksittäisten vaihtoehtojen tutkimiseen. Kuten sivuston ohjaama perimän muutoksia seuraa pienitehoinen määritys. Tämä lähestymistapa kiihdyttää muunnelmien funktion merkitystä, tunnistaa genomilaajuisten yhdistysten negatiiviset variantit (GWAS) ja ohjaa kliinistä tulkintaa personoidussa lääketieteessä.

Johdatus korkea-Throughput Toiminnallinen seulonta

Korkea-läpivienti toiminnallinen seulonta viittaa sarja kokeellisia menetelmiä, jotka järjestelmällisesti testata vaikutuksia lukuisia geneettisiä muutoksia mitattavissa biologinen lukema.Pohjimmiltaan periaate on luoda suuria kirjastoja muunnelmia sekvenssejä, tuoda ne asiaankuuluvaan solumalli, ja sitten lajitella tai mitata soluja perustuu fenotyyppi kiinnostusta (esim. geenin ilmentyminen, solujen kunto, proteiini aktiivisuus). Edistyminen DNA-synteesi, sekvensointi, ja automaatio ovat mahdollistaneet suunnitella, rakentaa ja testata kirjastot sisältävät kymmeniä tuhansia muunnelmia muutaman viikon aikana. Nämä menetelmät ovat ratkaisevia tulkittaessa valtava määrä vaihtoehtoja havaittu laajamittaisia sekvensointi hankkeita, erityisesti ne, jotka luokitellaan variantteja epämääräistä merkitystä (VUS).

Ydinteknologiat, joilla ajo on korkeaa suorituskykyä

Useat tehokkaat teknologiat tukevat modernia HTFS:ää, jolla kaikilla on omat vahvuutensa ja sovellukset.

CRISPR-perusnäytöt

CRISPR-Cas9-teknologia on mullistanut genomiikan antamalla mahdollisuuden skaalautua tarkasti genomimuokkausta varten. Tyypillisessä yhdistetyssä CRISPR-näytössä tuhannet genomisivustot (sgRNA) -kirjasto, joka keskittyy tuhansiin genomisivustoihin, toimitetaan soluihin, jotka ilmaisevat kasseja9. Tuloksena olevat editaatiot. Lisääntymiset, poistot tai pistemutaatiot. Tutkijat voivat arvioida tietyn pisteen mutaatioiden (CRISPR-yhdistelmän tai CRISPRkon), aktivoinnin (CRISPRa) tai eston (CRISPRi) vaikutuksia fenotyypissä tai sääntelyssä. Kehittyneemmät vaihtoehdot, kuten perustoimittajat ja päätoimittajat, mahdollistavat spesifisten pistemutaatioiden tarkan käyttöönoton, jolloin tiedetään tautiin liittyvien varianttien tai systemaattisten karttajäämien vaikutukset voidaan seuloa.

Rinnakkaisarvioinnit (MPRA)

MPRIA on menetelmä, jolla määritetään tuhansien sääntelyversioiden vaikutus geenien ilmentymiseen. Tyypillisessä MPRA:ssa DNA-sekvenssien (jokainen kiinnostava variantti) kirjasto kloonataan ennen minimaalisen promoottorin ja reportterigeenin (esim. GFP, luciferase tai viivakoodi). Kirjasto on otettu soluihin ja reportteri RNA:n tai proteiinin runsaus on määritetty sekvensoimalla. Vertaamalla aineistoa syöttökirjastoon tutkijat voivat mitata, miten kukin variantti muuttaa transkriptiotoimintaa. MPRA:ia on käytetty järjestelmällisesti GWAS-riskivarianttien arviointiin, toiminnallisen koodaamattoman mutaation tunnistamiseen sekä dissect promoter- ja tehostamislogiikkaan.

Muut korkean suorituskyvyn menetelmät

Tyydyttämismutaatio yhdistettynä syvään sekvensointiin (esim. syvämutaatioskannaus) mahdollistaa kaikkien mahdollisten yksittäisten aminohapposubstituutioiden toiminnallisuuden proteiinialueella. Synteettiset biologian työkalut, kuten sääntelysekvenssejä sisältävät kombinatoriset kirjastot, auttavat löytämään sekvenssitekijät, jotka vaikuttavat splaktion, käännöksien ja proteiinien vakauteen. Lisäksi tekniikat, kuten korkean läpiviennin fluoresenssiaktivoidut solulajittelu (FACS), jotka perustuvat raportoijan rakenteisiin, mahdollistavat solujen rikastumisen halutuilla muunnelmavaikutuksilla.

Viimeaikaiset innovaatiot ja metodologiset edistysaskeleet

Ala kehittyy nopeasti, ja uudet menetelmät lisäävät resoluutiota, vähentävät kustannuksia ja yhdistävät täydentäviä tietotyyppejä.

Integrointi yhden kerroksen sekvensointiin

Yksi jännittävimmistä viimeaikaisista kehitysvaiheista on yhdistetty yhdistettyjä ruutuja yhden solun lukemiin (esim. Perturb-seq, CROP-seq). Sen sijaan, että mitattaisiin kokonaispopulaation keskiarvoa, nämä lähestymistavat ottavat talteen yksittäisten solujen transkriptomisia, proteomisisia tai epigenomisia profiileja perturbaation jälkeen. Tämä paljastaa solukohtaisia vaikutuksia, heterogeenisyyttä varianttien vaikutuksessa ja geneettisten muutosten pleiotrooppisia seurauksia. Yksisoluresoluutio on erityisen arvokasta kehityksen prosessien, immuunivasteiden ja syöpäkehityksen tutkimisessa, jossa väestön keskiarvot voivat peittää tärkeitä alapopulaatioita.

Koneoppiminen varianttien priorisointia varten

Koneoppimisen algoritmit ovat nyt erottamaton osa HTFS-työvirtaa. Ne auttavat suunnittelemaan versiokirjastoja ennustamalla, mitkä mutaatiot ovat todennäköisimpiä toiminnallisen (esim. evoluution säilyvyyden, proteiinirakenteen tai kromatiinin tilan perusteella). Seulonnan jälkeen ML-mallit voivat integroida laaja-alaisia tietokokonaisuuksia, joiden avulla voidaan luokitella variantteja patogeenisiksi tai hyvänlaatuisiksi, priorisoida validointia varten ehdokkaita ja päätellä taustalla olevia mekanismeja. Syväoppimisen arkkitehtuurit, kuten convolutionaaliset hermoverkot (CNNs) ja muuntajat, jotka on koulutettu massiivisiin genomisiin tietokantoihin, ovat osoittaneet vaikuttavan tarkkuuden toiminnallisten vaikutusten ennustamisessa ja niitä on jalostettu jatkuvan palautteen avulla kokeellisista näytöistä.

Moniomististen teknologioiden integrointi

Yhdistämällä HTS muiden omics kerrokset.kuten proteomiikka, metabolomiikka, tai epigenomiikka.Tuottaa täydellisemmän kuvan varianttifunktio. Esimerkiksi, kytkemällä MPRA kromaattien accessibility määritykset (esim., ATAC-seq) voi paljastaa, vaikuttavatko sääntely muunnokset transkriptiotekijän sitova asiayhteydestä riippuvalla tavalla. Tällaiset integrointi lähestymistavat ovat välttämättömiä ymmärtää monimutkainen vuorovaikutus genotyyppi ja fenotyyppi.

Tutkimus- ja lääkealan sovellukset

HTFS on jo muuttanut kykyämme tulkita genomivaihtelua ja muuntaa se kliiniseksi käytännön käytännöksi.

Epävarman merkittävyyden varianttien toiminnallinen huomautus

Merkittävä pullonkaula kliinisessä genomiikassa on suuri osuus geenitesteissä raportoidusta VUS-arvosta. HTFS voi järjestelmällisesti arvioida tuhansien VUS-geenien toiminnan vaikutuksia perinnöllisten häiriöiden kannalta merkityksellisissä geeneissä, kuten BRCA1[], ]TP53[]] ja [[]CFTR[]]. Toiminnallista näyttöä antamalla nämä näytöt auttavat luokittelemaan vaihtoehdot uudelleen hyvänlaatuisiksi tai patogeenisiksi, parantamaan suoraan diagnostista tuottoa ja potilaiden hallintaa.

Farmakogenomiikka ja lääkekehitys

Korkea läpivienti näytöt voivat tunnistaa geneettisiä muunnelmia, jotka muuttavat huumevastetta, mikä mahdollistaa ennuste haittavaikutusten tai teho. Lääkelöydöksen HTS käytetään kartoittaa resistenssimutaatioita syöpä kohdegeenit, auttaa suunnittelemaan seuraavan sukupolven estäjiä. Lisäksi profiloimalla täyden mutaation maiseman huumekohteet, tutkijat voivat ennakoida, miten kasvaimet voivat kehittää resistenssiä ja kehittää yhdistelmähoitoja vastaavasti.

Tautimekanismien ymmärtäminen

Seuloa suuria varianttikirjastoja taudin kannalta merkityksellisissä solutyypeissä (esim. neuronit, kardiomyosyytit, immuunisolut) paljastaa syy-variantit ja niiden vaikutusreitit. Esimerkiksi tutkimukset ovat käyttäneet CRISPR-seulontoja syöpäsolujen keskeisten geenien tunnistamiseen, paljastaen uusia terapeuttisia haavoittuvuuksia. Neurokehityksessä MPRA:t ovat paikantaneet tehostajamutaatioita, jotka häiritsevät geenien säätelyä kortikaalisen kehityksen aikana, tarjoten mekanistisia oivalluksia olosuhteisiin kuten autismiin ja skitsofreniaan.

Nykyiset rajoitukset ja tulevaisuuden ohjeet

HTFS:llä on valta-asemastaan huolimatta edessään useita haasteita, joihin on vastattava, jotta se voi täyttää potentiaalinsa.

Skaalattavuus ja kustannukset

Vaikka DNA-synteesin ja sekvensointien kustannukset ovat laskeneet dramaattisesti, suuret näytöt. Erityisesti ne, jotka vaativat mukautettuja solulinjoja, yksisolusekvensointia tai monimutkaisia fenotyyppisiä määrityksiä.

Biologinen monimutkaisuus ja kontekstin erityisyys

Muunnelmavaikutukset voivat olla erittäin riippuvaisia solutyypistä, geneettisestä taustasta, ympäristöstä ja epigeneettisestä tilasta. Muunnos, joka on hyvänlaatuinen yhdessä yhteydessä, voi olla patogeenistä toisessa. 3D-genomiarkkitehtuuri, splixing-sääntely ja translaation jälkeiset muutokset lisäävät monimutkaisia kerroksia, joita on vaikea saada kiinni yksinkertaistetuissa mallijärjestelmissä. Organoideissa, yhteisviljelmissä ja in vivo -seulonnassa (esim. CRISPR:n käyttö hiirissä tai seebrafiseissa) on alkanut käsitellä kontekstiriippuvuutta, mutta merkittävä työ on vielä jäljellä.

Tietojen analysointi ja tulkinta

HTFS:n tuottamat pelkät tiedot ovat erittäin suuria. HTS:n ja muiden genomiresurssien (esim. ]ENCODE, ClinVar, gnomAD) aiheuttamat väärät positiiviset tulokset ovat edelleen haasteellisia. Metadatan standardoinnin, yhteisten tietomallien kehittämisen ja tulosten jakamisen julkisten arkistojen kautta (esim. ] ClinVar[) on edelleen tärkeää, jotta voidaan maksimoida näiden tutkimusten vaikutukset.

Päätelmät

Korkean läpimenotason toiminnallinen seulonta on siirtynyt erikoistekniikasta nykyaikaisen genomiikan kulmakiveksi. Mahdollistamalla geneettisen vaihtelun systemaattisen arvioinnin nämä menetelmät nopeuttavat toiminnallisten elementtien löytämistä, parantavat kliinisen genomiikan varianttitulkintaa ja tarjoavat uutta tietoa sairausbiologiasta. Kehittyvä teknologia, kuten yksisoluinen resoluutio, koneoppiminen ja moniomiikka, lupaavat parantaa entisestään ymmärrystämme siitä, miten geenimuunnokset muokkaavat ihmisten terveyttä. Kustannusten pienentyessä ja menetelmien muuttuessa helpommin saavutettaviksi, HTFS:stä tulee yhä tärkeämpi väline sekä tutkijoille että kliinikoille, joka auttaa kuromaan umpeen genotyyppien ja fenotyypin välisen kuilun.

Kokonaiskuva genomitekniikan toiminnasta on Canver et al. (2017) -julkaisussa Nature Reviews Genetics. Lisäresursseja varianttitulkintaan löytyy ClinVar-tietokannasta ja NITH Genome Sekvensointiohjelmasta .