Kromatografian periaatteet

Kromatografia erottaa molekyylit niiden differentiaalijakaumasta kiinteän vaiheen ja liikkuvan vaiheen välillä. Kiinteä vaihe voi olla kiinteä tai neste päällystetty kiinteällä tuella, kun taas liikkuva vaihe on neste tai kaasu, joka kuljettaa näytteen järjestelmän kautta. Yhdisteet ovat vuorovaikutuksessa kiinteän vaiheen kanssa []adsorption[[]], [-partition[]], [-ion-vaihdon [[]] tai [[]-koon ulkopuolelle [[[]]], jolloin ne poistuvat eri aikoina. Tämä erotusteho on välttämätön monivaiheisten biologisten matriisien ratkaisemiseksi.

Useat parametrit vaikuttavat erotustehoon: kolonnin mitat, [partikkelikoko[, virta [] ja []-mobiilivaihekoostumus[]. Nykyaikaiset laitteet käyttävät korkeaa painetta saavuttaakseen nopeammat ja tehokkaammat erot. Esimerkiksi ultra-tehokas nestekromatografia (UHPLC) toimii yli 15 000 psi:n paineissa, mikä vähentää ajoaikoja ja ylläpitää korkeaa resoluutiota.

Metabolomiikan keskeiset kromatografiatekniikat

Kaasukromatografia (GC)

GC on ihanteellinen volatiilille[ ja ] lämpövakauttaville [ metaboliiteille. Näytteet höyrystyvät ja läpäisevät kolonnin, joka on päällystetty nestemäisellä paikallaan olevalla faasilla, jossa on inerti kaasu (esim. helium) liikkuvana vaiheena. Derivatisointia vaaditaan usein polaaristen metaboliittien haihtuvien . Yhteisiin reagensseihin kuuluvat silylatoivat aineet ja metyyliasettavat yhdisteet. GC yhdistettynä massaspektrometriaan (GC-MS) tarjoaa ]electronionisation (EI) [[] spektrit, jotka ovat erittäin toistettavissa eri instrumenttien välillä, mikä mahdollistaa kirjastopohjaisen tunnistamisen. Tämä tekee GC-MS:stä standardin, joka on tarkoitettu kohdemetaboliitin, kuten aminohappojen, rasvahappojen ja sokerien, kohdentamattomalle aineenvaihduntaalustalle.

Nestekromatografia

LC-kahvat ]-ei-volatiili- ja lämpölabiili[-yhdisteet. Monet metabolomiset tutkimukset käyttävät [-reversed-phase (RP) LC[]-komponentteja, jotka kattavat ei-polaarisen polaarisen molekyylin, tai hydrofiilisen yhteisvaikutuskromatografian (HILIC)[]-kompoliittisten metaboliittien työhevonen. [Ultra-korkeatehoisen nestekromatografian (UHPLC) [ vähentää hiukkaskokoa alle 2 μm, lisää merkittävästi resoluutiota ja nopeutta. LC-MS, jossa on elektrosfaattiionionisaatio (ESI) on työhevosta.

Kapillaari-Elektroforeesi (CE)

CE erottaa ionit niiden ]electrophoreettisen liikkuvuuden [] perusteella kapeassa kapillaarissa sähkökentän alla. Se on erityisen tehokas n suuren polaarisen[ ja ]-latauksen kohteena olevien metaboliittien, kuten nukleotidien, orgaanisten happojen ja fosforiyhdisteiden osalta. CE-MS tarjoaa erinomaisen erotustehokkuuden ja alhaisen näytteenkulutuksen, vaikka sitä käytetään vähemmän kuin LC:tä tai GC:tä.

Kromatografian integrointi massaspektrometriaan

Dialyysin avulla voidaan analysoida yhdisteitä erikseen. High-resolution massaspektrometria (HRMS)[ (esim. Q-TOF, Orbitrap) tarjoaa tarkkoja massamittauksia metaboliittien tunnistamiseen. Tandem massaspektrometria (MS/MS) [ tuottaa rakenteellista tietoa sirpaloitumismallien kautta. Tiedonhankintaan kuuluvat []full-scan[]]] -mittausmenetelmät kohdentamattomalle profiloinnille ja [ - monimuotoreaktion seuranta (MRM)] ]].

Metabolomiikka Workflow

Näytteen valmistelu

Oikea näytteen valmistus on kriittinen. Metaboliitit ovat nopeasti käännettävissä, joten aineenvaihdunta on tehtävä [-korjattu[ välittömästi (esim. kylmä metanoli). Extraction[]-menetelmät, kuten bifaasinen neste-nesteen uuttaminen (esim. metanoli/kloroformi/vesi) erilliset polaariset ja ei-polaariset jakeet. Näyte -derivalisaatio[]] GC-MS- tai -proteiinin saostuminen [] LC-MS-yhdisteille ovat yhteisiä vaiheita. Sisäiset standardit lisätään matriisivaikutusten ja instrumenttien diffraktion korjaamiseen.

Erotus ja detektorointi

Kromatografiaolosuhteet optimoidaan metaboliittiluokkien mukaan. Esimerkiksi C18-kolonni, jossa on vesi-asetonitriiligradientti ja 0,1 prosenttia muurahaishappoa, sopii useimmille lipidomikoille. HILIC-kolonnit käyttävät korkeaa orgaanista sisältöä liikkuvia faasia polaarisille metaboliiteille. Saranan lämpötila, virtausnopeus ja injektiotilavuus säädetään huippukapasiteetin maksimoimiseksi ja toistettavuuden lisäämiseksi.

Tietojenkäsittely

Raakakromatografia... massaspektrometriatiedot läpikäyvät [peak detection[, [-asennuksen[-normalisoinnin[[] (esim., kokonaisionin määrä tai sisäinen standardi). Työkalut kuten XCMS, MZM-MZmine ja Compound Discoverer automatisoivat nämä vaiheet. [Statistinen analyysi[ ...] ......................................................................................................................

Metabolomiikka Lähestymistavat

Kohdistamattomat metabolomics

Kohdistamattomat metaboliset aineet pyrkivät havaitsemaan mahdollisimman monta aineenvaihduntaa ilman aikaisempaa tietoa. [Global profilointi tuottaa hypoteesia metabolisista häiriöistä. Kromatografian on oltava laaja-alaista tai useita sarakkeita. Esimerkiksi kaksikolonninen lähestymistapa (RP-LC ja HILIC) kattaa sekä polaariset että ei-polaariset yhdisteet. Kohdistamattomat tiedot ovat puolikvantitatiivisia ja vaativat huolellista validointia.

Kohdennetut metabolomics-tutkimukset

Kohdennetut metaboliset aineet keskittyvät ennalta määriteltyjen aineenvaihduntatuotteiden, usein biomarkkerien, kvantifiointiin. [Tavanomaiset isotooppimerkityt sisäiset standardit [ mahdollistavat absoluuttisen kvantitatiivisen määrän. Kolminkertaisen nelinkertaisen instrumentin MRM tarjoaa suuren herkkyyden ja spesifisyyden. Kromatografia optimoidaan kohdeyhdisteille, usein lyhyemmänkin ajan korkealle läpimenolle.

Kromatografian rooli biomarkkerin löydössä

Löytövaihe

Biomarkkerien löytämisessä kromatografia erottaa monimutkaiset biologiset nesteet (plasma, virtsa, kudosuutteet) sairauden kanssa korreloivien metaboliittien paljastamiseksi. Esimerkiksi [haaraketjuiset aminohapot [] tunnistettiin varhaisiksi insuliiniresistenssin markkereiksi LC-MS:n avulla. Kohdistamattomat tutkimukset vertaavat kohortteja ja sadat ehdokaspiirteet vähenevät muutamaan kymmeneen tilastollisen suodatuksen kautta.

Validointivaihe

Lupaavat biomarkkerit on validoitava suuremmissa, riippumattomissa kohorteissa. Kromatografiassa on annettava validointiin tarvittava [reproducibility[]. Säilyttämisajan vakaus ja massatarkkuus takaavat yhdenmukaisen tunnistamisen. [ Menetelmien validointi[] sisältää lineaarisuuden arvioinnin, havaitsemisrajan, tarkkuuden ja tarkkuuden. Validoitu määritys on välttämätön ennen kliinistä kääntämistä.

Kliininen käännös

Siirtyminen tutkimuksesta kliiniseen diagnostiikkaan edellyttää vankkoja, korkeatehoisia menetelmiä. Kromatografiaan perustuvia biomarkkerien määrityksiä, kuten [homokysteiini] (LC-MS/MS) ja vitamiini D-metaboliitteja[ (LC-MS) käytetään jo kliinisissä laboratorioissa. Automaatio (esim. online SPE yhdistettynä LC-MS:ään) vähentää manuaalista käsittelyä ja lisää läpimenoa.

Tapaustutkimukset taudin merkkiaineissa

Syöpä Metabolomiikka

Syöpäsoluilla on muuttunut aineenvaihdunta . Warburg-vaikutus[ (aerobinen glykolyysi). Kromatografia mahdollisti suurentuneen laktaattipitoisuuden, muuttuneen TCA-syklin väliaineiden ja nukleotidimetaboliitin muutosten löytymisen. Esimerkiksi [2-hydroksiglutaraatti[ on onkometaboliitti IDH-mutanttiglioomat, jotka GC-MS havaitsi. LC-MS:ää käyttävät lipidomit ovat paljastaneet rintojen ja eturauhasten syöpien muuttuneita fosfolipidiprofiileja.

Diabetes - ja aineenvaihduntaoireyhtymä

Metabolinen oireyhtymä liittyy lipidien, aminohappojen ja glukoosin dysregulointihäiriöihin. Kromatografiatutkimuksissa on tunnistettu [BCAAs[], aromaattiset aminohapot[ (tyrosiini, fenyylialaniini), ja []asyylikarnitiinit[] tyypin 2 diabeteksen ennustamiseksi. LC-MS-profilointi seramideista ja diasyyliglyseroleista yhdistää lipidiaineenvaihdunnan insuliiniresistenssiin. Näitä merkkejä validoidaan nyt laaja-alaisissa kohorteissa.

Neurorappeumasairaudet

Alzheimer-, Parkinson- ja ALS-sairauksiin liittyy aivojen ja reuna-alueiden metabolinen toimintahäiriö. [Lipidomisia[]]-lääkkeitä käytettäessä LC-MS-lääkkeitä havaittiin muutoksia sfingolipideissä ja sterolissa aivo-selkäydinnesteessä. [Polyamiinitasot[[] (spermidiini, putressiini) muuttuvat Alzheimer- soluissa, jotka HILIC-MS havaitsi. Kromatografiset menetelmät auttavat tunnistamaan metaboliitin allekirjoitukset, jotka korreloivat kognitiivisen laskun kanssa.

Haasteet ja ratkaisut

Matrix- vaikutukset ja ionin suppressio

Koluteena toimivat yhdisteet voivat estää ionisaation MS:ssä [].Parempi kromatografiaresoluutio vähentää koeluutiota. -isotooppimerkittyjen sisäisten standardien [ avulla voidaan kompensoida matriksivaikutuksia. Kaksiulotteinen kromatografia (LC×LC) tai offline-jakotislaus voivat edelleen puhdistaa näytteitä.

Tietojen uusittavuus

Laataston välinen vaihtelu on edelleen este. Standardoidut protokollat, laadunvalvontanäytteet ja laboratorioiden väliset tutkimukset[ (esim. NIST SRM 1950 -järjestelmän avulla) parantavat toistettavuusastetta. Säilyttämisaikaindeksit -alkyyliamiinien tai muiden kalibranttien avulla voidaan yhdenmukaistaa tietoja eri ajoilla.

Laaja-alaiset tutkimukset

Populaatiotason metabolomiikka vaatii tuhansien näytteiden käsittelyä. Automaattinen näytteen valmistelu[ (robotiikka) ja U(H)PLC lyhyillä sarakkeilla[] (esim. 5 minuutin kaltevuudet) mahdollistavat korkean läpiviennin. []Pilkkojen korjaus[] algoritmeilla (esim. QC-pohjainen korjaus) osoiteajon pitkillä sekvensseillä.

Tulevaisuuden näkymät

Korkearesoluutioiset erot

Sarakkeessa (esim. ]-sub-2 μm:n ytimen kuorihiukkaset[]) ja [ion-liikkuvuusspektrometria[ (IMS) lisätään yhteentörmäyspoikkeavuuteen perustuva erotusmitta. []]LC-IMS-MS[] voi ratkaista isomeerit ja lisätä huippukapasiteettia. [ Laaja kaksiulotteinen GC (GC×GC)[] on saamassa vetoa haihtuvien metaboloivien aineiden osalta.

Automaatio ja Miniaturization

Mikronestelaitteet ja digitaaliset mikronesteet[] kehitetään mikrosirulla olevien näytteiden valmistelua ja erottamista varten. Automatisoitu online-SPE-LC-MS[-järjestelmät vähentävät manuaalisia vaiheita ja lisäävät uusittavuutta. Nämä teknologiat tekevät kromatografiasta helpommin saatavilla kliinisille laboratorioille.

Integrointi koneoppimiseen

Koneoppimisalgoritmit ennustavat retentioaikoja, auttavat MS/MS-spektrin metaboliittien havainnoinnissa ja tunnistavat kuvioita suurissa tietokokonaisuuksissa. Kromatografian retentiotietojen yhdistäminen massaspektritietoihin parantaa luottamusta biomarkkerien tunnistamiseen. [] Syväoppiminen[] -malleissa voi myös ehdottaa optimaalisia erotteluolosuhteita.

Päätelmät

Kromatografia on edelleen välttämätön työkalu metabolomiikka ja biomarkkereiden löydösten. Tuhansien aineenvaihduntatuotteiden erottamisesta kliinisten biomarkkerien validointiin, kromatografiset tekniikat tarjoavat resoluution, uusittavuuden ja kvantitatiivisen tarkkuuden. Koska instrumentointi kehittyy suuremmilla paineilla, parempien kolonnikemia, ja integrointi ionin liikkuvuutta ja automaatiota . kromatografia jatkaa etenemistä tarkkuuslääketieteessä ja metabolisessa fenotyping. Tutkijoiden tulisi harkita kunkin tekniikan (GC, LC, CE) vahvuuksia ja suunnittelutyön virtauksia, jotka maksimoivat metabolisen osan kattavuuden säilyttäen samalla tiedon laadun.

Lisätietoja on ]Luonnon metabolomiikka -aiheessa [, [Cromatography Online resource[, ja tuore -katselu biomarkkereiden LC-MS-löydöstä[. Lisäksi []Human Metabolome -tietokanta (HMDB) tarjoaa viitespektriä ja reittitietoja sekä Metabolomics Workbench[] tarjoaa julkisia tietokantoja ja analyysityökaluja.