Johdatus magneettinen helmi-pohjainen solujen erotus

Solujen erottaminen on kulmakivi tekniikka modernissa biologiassa ja lääketieteessä, jonka avulla tutkijat voivat eristää tiettyjä solupopulaatioita heterogeenisistä seoksista jatkoanalyysiin, kulttuuriin tai terapeuttiseen käyttöön. Erilaisten erotustekniikoiden joukosta magneettihelmiin perustuvat menetelmät ovat saaneet laajan hyväksynnän niiden yhdistelmästä nopeuden, yksinkertaisuuden ja lempeän käsittelyn ansiosta. Nämä menetelmät perustuvat superparamagneettisiin helmiin, jotka toimivat vasta-aineilla tai ligandeilla, jotka sitoutuvat kohdesolun pintamarkkereihin, jolloin tehokas eristäminen magneettikentässä on kehittynyt kahden viime vuosikymmenen aikana kapeasta laboratoriotyökalusta standarditekniikkana, jota käytetään perustutkimuksessa, kliinisessä diagnostiikassa ja soluterapian valmistuksessa.

Magneettihelmien perusteet

Magneettihelmet ovat tyypillisesti pallomaisia hiukkasia, joiden halkaisija vaihtelee nanometristä mikrometriin, ja koostuvat magneettisilla nanopartikkeleilla kyllästetystä polymeeristä tai piidioksidimatriisista (usein rautaoksidista, Fe[]3[[]]]4[[]]] tai γ-Fe[[]]2[[[]]3[[]]]))) valmistetuista komponenteista. Avainominaisuus on superparamagnetismi: helmillä on vahva magnetisointi vasta silloin, kun ne altistuvat ulkoiselle magneettikentälle ja säilyttävät jäljellä olevan magnetismin kenttästä poistamisen jälkeen. Tämä behavior estää integroitumisen ja mahdollistaa uudelleenjaon erottelun erotusvaiheen jälkeen.

Magneettisolujen erotusta koskevat periaatteet

Erotusprosessi voidaan jakaa kahteen päämenetelmään: positiivinen valinta ja negatiivinen (depletion) valinta. Positiivisessa valinnassa helmet konjugoidaan vasta-aineisiin, jotka tunnistavat kohdesolupopulaation. Inkubaation jälkeen helmeen sitoutuneet solut vangitaan magneettikentällä, kun taas sitoutumattomat solut heitetään pois. Negatiivisessa valinnassa helmet sitoutuvat ei-toivottuihin soluihin, jotka on magneettisesti poistettu, jolloin kohdesolut eivät pääse helmiin. Tämä jälkimmäinen menetelmä on suositeltava, kun kohdesolut ovat harvinaisia, hauraita tai niitä ei saa merkitä toiminnallisia tutkimuksia varten.

Askeleet magneettisessa erotuksessa

  1. Valmistus:[ Kudosjakauma, gradientin sentrifugointi tai punasolujen hajoaminen yhden solun suspension saamiseksi. Suodatus 30.40 μm:n silmän läpi tehdään usein kokkareiden poistamiseksi.
  2. Inkubaatio magneettihelmillä:[] Solususpensio sekoitetaan ennalta määrättyyn määrään helmi-vasta-aine konjugaatti. Inkubaatio-olosuhteet (aika, lämpötila, kiihtymys) optimoidaan maksimoimaan sitovan ja minimoimaan epäspesifinen tarttuvuus.
  3. Magneettinen talteenotto:[] Seos sijoitetaan magneettikenttään (käyttäen pysyvää magneettia kolonnissa, putki, tai levymuodossa). Helmiin sidottuja soluja siirtyä kohti magneettia, kun taas sitoutumattomat solut pestään pois.
  4. Pesun vaiheet:[ Useita pesuja puskurilla (usein PBS 0,5%:lla BSA:lla ja 2 mM EDTA:lla) poista saastuttavat sitoutumattomat solut ja jäännöshelmet.
  5. Tutkitaan:[] Positiivisen valinnan osalta talteen otetut solut voidaan eluoida poistamalla magneetti ja sekoittamalla pelletti. Vaihtoehtoisesti soluja voidaan käyttää suoraan magneettiin myöhemmissä määrityksissä.

Magneettierotusjärjestelmien tyypit

Saatavilla on useita kaupallisia alustoja, joista jokainen on optimoitu eri läpimeno- ja automaatiotasoille. Yleisimpiä ovat:

  • Kolumnipohjaiset järjestelmät (esim. Miltenyi Biotec MACS):[ solut kulkevat teräsvillakolonnin läpi, joka on sijoitettu vahvaan magneettikenttään. Helmimerkityt solut säilytetään, kun taas leimaamattomat solut virtaavat läpi. Sarake pestään ja poistetaan magneettista siten, että se poistaa sidotun fraktion. Tämä järjestelmä voi käsitellä suuria solumääriä (enintään 109[]) ja saavuttaa korkean puhtauden.
  • Tubeen perustuvat tai levypohjaiset järjestelmät (esim. Dynabeads, StemSep):[] Helmiin sekoitetut solut sijoitetaan putki- tai mikrolevyn lähelle magneettia. Helmiin sidotut solut vedetään sivuun tai pohjaan ja supernatantti poistetaan. Tämä lähestymistapa on yksinkertaisempi ja nopeampi, mutta se voi olla pienempi läpivienti.
  • Mikronesteenkäsittelylaitteet:[] Kehittyvä teknologia käyttää mikrokanavia integroiduilla magneeteilla tai magneettikentän kaltevuuksilla erottaakseen soluja yhden solun tasolla. Nämä ovat lupaavia harvinaisten solujen eristämiseksi, mutta eivät vielä ole valtavirtaan.

Edut yli perinteisten menetelmien

Magneettihelmen erottelu tarjoaa useita etuja verrattuna virtaussytometriaan perustuvaan lajitteluun (FACS) tai tiheysgradientin sentrifugointiin:

  • Nopeus:[ Tyypilliset protokollat kestävät 30.60 minuuttia verrattuna tuntiin FACS:ssä, jolloin se soveltuu useiden näytteiden käsittelyyn samanaikaisesti.
  • Kalibrointikyky:[] 10[5[ 1010]] soluja voidaan käsitellä yhdellä juoksulla järjestelmästä riippuen. Tämä on ratkaisevan tärkeää kliinisen mittakaavan soluterapian kannalta.
  • Säilyvyys:[ Ei kalliita laitteita (vain magneetti vaaditaan) ja minimaalinen operaattorikoulutus. Protokolla on yksinkertainen ja toistettavissa.
  • Huonon käsittely:[ Leikkausvoimat ovat alhaiset, eikä soluihin kohdistu korkeapaine- tai sähkökenttiä. Elinkyky yleensä ylittää 90%.
  • Versatiliteetti:[ Sovelletaan useisiin solutyyppeihin, mukaan lukien primaarisolut, kantasolut, bakteerit ja jopa soluttomat organellet. Helmet voidaan myös funktionaalisoitu proteiinin tai nukleiinihapon talteenottoon.

Huomiot ja rajoitukset

Vaikka sen edut, magneettihelmen erottaminen on cavenats. Helmen poisto on harkittava sovelluksissa, joissa helmiä voi häiritä, kuten funktionaalisissa määrityksissä tai siirto. Jotkut järjestelmät mahdollistavat entsymaattisen tai mekaaninen helmi irtoaminen, mutta tämä voi vaikuttaa solujen elinkelpoisuutta tai merkkien ilmentymistä. Lisäksi, side helmiä solujen pinta-antigeenejä voi laukaista signaalin tai aktivointi, muuttaa solujen käyttäytymistä. Negatiivinen valinta, ehtymistehokkuus on vahvistettava virtaussytometria. Lopuksi, kustannukset voivat olla merkittäviä laajamittaisissa tutkimuksissa, vaikka monet protokollia mahdollistaa uudelleenkäyttämisen helmiä rajoitettu jaksoja.

Tutkimus- ja lääkealan sovellukset

Magneettisolujen erottelua käytetään laajasti biolääketieteen eri aloilla.

Immunologia

T-soluryhmien (esim. CD4+, CD8+), B-solujen, luonnollisten tappajasolujen, dendriittisolujen ja monosyyttien eristäminen funktionaalisia kokeita, sytokiiniprofilointia tai adoptiivisia siirtokokeita varten. Negatiivinen valinta on suositeltava koskemattomille T-soluille aktivoinnin välttämiseksi.

Syöpätutkimus

Rikastus verenkierrossa kasvainsoluja (CCC) käyttämällä anti-EpCAM tai anti-HER2 helmiä. Tämä mahdollistaa noninvasiivisen seurannan kasvaimen etenemistä ja hoitovaste. Samoin, syövän kantasoluja voidaan rikastuttaa perustuu CD44-CD24 ilmentymä.

Kantasolubiologia

Positiivinen valinta hematopoieettisia kantasoluja (CD34+) luuytimestä tai mobilisoitu perifeerinen veri elinsiirtoa varten. Mesenkymal kantasolut (MSC) ovat usein eristetty negatiivisella valikoinnilla poistaa ei-toivottuja soluja.

Regeneratiiviset lääkkeet

Soluterapian valmistus perustuu magneettiseen erotteluun terapeuttisten solujen puhdistamiseksi ennen infuusiota. Esimerkiksi CAR-T-hoidon T-solut eristetään magneettihelmillä ennen geneettistä muuntelua.

Mikrobiologia

Magneettihelmet päällystetty vasta-aineita bakteeri- tai virusantigeenejä mahdollistaa patogeenien havaitseminen tai eristäminen monimutkaisia näytteitä. Tätä käytetään elintarvikkeiden turvallisuuden ja kliinisen diagnostiikan.

Tulevaisuuden linjaukset ja innovaatiot

Ala kehittyy edelleen. Viimeaikaisia kehityskulkuja ovat:

  • Multiparametrinen erottelu:[ Käyttämällä useita helmityyppejä, joilla on eri kokoisia/magneettisia ominaisuuksia, useiden populaatioiden eristämiseksi samanaikaisesti.
  • Automaatio ja mikronesteet: Integrointi nestemäisiin käsittelyrobotteihin, jotka on tarkoitettu suuriläpivirtausnäytteen pienitehoiseen käsittelyyn.
  • Parannettu helmimalli:[ Biohajoavat helmiä, jotka hajoavat sisäistymisen jälkeen, tai nanokokoisia helmiä, joita voidaan käyttää solunsisäiseen jakeluun.
  • Yhdistäminen muiden teknologioiden kanssa:[ Esirikastaminen magneettihelmillä, joita seuraa FACS ultrapuhtaille populaatioille.

Magneettihelmiteknologian kypsyessä se todennäköisesti muuttuu entistäkin kiinteämmäksi yksilölliseksi lääketieteessä ja solupohjaisissa hoidoissa.

Päätelmät

Magneettinen helmisoluerotus on muuttanut tapaa, jolla tutkijat eristävät ja puhdistavat tiettyjä solutyyppejä monimutkaisista seoksista. Sen yhdistelmällä nopeus, yksinkertaisuus ja lempeä käsittely, se on välttämätön työkalu sekä perustutkimuksessa että kliinisissä sovelluksissa. Periaatteiden ymmärtäminen, sopivan järjestelmän valinta ja optimointi ovat ratkaisevan tärkeitä korkean puhtauden, elinkelpoisten solujen saamiseksi. Jatkuva kehitys lupaa vieläkin suurempaa toiminnallisuutta ja integrointia, mikä varmistaa, että magneettihelmien erottelu pysyy kulmakivenä tulevina vuosina.

Lisälukema: Miltenyi et al. . . . . . ... Magneettinen solujen erottaminen (Luonnon Biotekniikka) , ]Magneettihelmien uudelleentarkastelu solueristyksen aikana (Mynologian tapojen aika)[], [[]Sigma-Aldrichin tekninen opas magneettihelmiin[.[[]