Kartila- ja luusolukulttuurin haasteiden ymmärtäminen

Kartilage ja luukudokset ovat joitakin kaikkein pelottavimpia esteitä primaarisoluviljelmän koska niiden ainutlaatuinen rakenteellisia ja biokemiallisia ominaisuuksia. Karttilage, erityisesti nivelrusto, on verisuoni ja sisältää harvaan populaation kondrosyyttejä upotettu tiheä ekstrasolun matriisi (ECM) runsaasti kollageeni tyyppi II, aggrecan, ja proteoglykaanit. Tämä matriisi ei ainoastaan vastusta entsymaattisen ruoansulatusta, mutta myös rajoittaa ravinteiden diffuusio, joten solujen talteenotto ja sen jälkeinen proliferaatio on suuri haaste. Bone, toisaalta, on mineralisaation kudos koostuu hydroksiapatiitti kiteitä talletettu kollageeninen telineen. Läsnäolo kalsiumfosfaatti kiteet vaativat dekalsifikaatio vaiheet, jotka voivat vaarantaa solujen elinkelpoisuutta, jos ei huolellisesti hallinnassa. Lisäksi kudoksia on alhainen solujen tiheys (chondrocytes osuus on alle 5% rustotilavuudesta, ja osteosyyttejä on vastaavasti niukkaa kortillinen luuta), mikä tarkoittaa, että jokainen elinkykyinen solu on talteen.

Solueristämisen ja kulttuurin strategiat

Entsymaattinen digestio

Kolmageeni (tyypit I, II tai seos) on yleisimmin käytetty entsyymi, koska se hajottaa kollageenifibrilejä ja vapauttaa antrapped soluja. Rustossa kaksivaiheinen ruoansulatus tuottaa usein paremman elinkelpoisuuden: ensinnäkin lyhyt hoito trypsiinillä tai pronaasilla poistaakseen pintaproteoglykanseja, minkä jälkeen solut siirtyvät pitkittyneellä inkubaatiolla (4...18 tuntia) kollageenin kanssa pieninä pitoisuuksina (0,1...0,2% w/v). Luun osalta kollageenin ja distaasin (neutraali proteaasi) yhdistelmä voi lyse-solujen tai lyoiduttaa solujen pintareseptorien tehokkuutta, mikä vähentää niiden kiinnittymistä. Hellästi ravistaminen ja jaksoittainen trituraatio parantaa solujen vapautumista. Kun solut ovat digestiossa, soluja siirretään 70.100 μm läpi pieninä pitoisuuksina ja niiden kautta poistetaan syövyttävällä sininen solumäärä.

Kudoskalkifiointi luun osalta

Ennen kuin entsymaattisen mädätyksen jälkeen luukudos on dekalisoitunut mineraalimatriisin pehmentämiseksi.Kaksi primaarista lähestymistapaa ovat kelaatinmuodostavat aineet (esim. EDTA) ja hapot (esim. suola tai muurahaishappo). EDTA neutraalissa pH:ssa on suositeltavampi tutkimuksissa, jotka edellyttävät korkeaa solujen elinkelpoisuutta, koska se kelatoi kalsiumioneja vahingoittamatta soluproteiineja. Tyypilliset protokollat inkuboidaan luunfragmenttien inkubaatiossa 0,5 M EDTA (pH 7,4) 4 °C:ssa 24ha 9772 tunnin ajan, liuos huuhdellaan perusteellisesti ja käsitellään sen jälkeen standardientsymaattisella digestiolla. Happopohjainen kalkinfiointi on nopeampaa mutta aggressiivisempaa, ja se on usein varattu histologiseen analyysiin, jossa solujen elinkyky on vähemmän kriittinen.

Mekaaninen dissosiaatio ja mikrodiffuuso

Erittäin pienissä biopsioissa tai kun entsymaattiset mädätys on epäkäytännöllistä, voidaan käyttää mekaanisia menetelmiä. Mikrodispektio stereomikroskoopin avulla mahdollistaa rustolastujen tai trabekulaaristen luulastujen tarkan eristämisen, minimoimalla kontaminaatiota ympäröivistä kudoksista. Myöhemmät jauhamalla skalpelleilla syntyy pieniä kasveja, jotka voidaan sijoittaa suoraan viljelyastioihin (explant-viljely). Vaikka tämä tuottaakin aluksi vähemmän soluja, solujen kasvu eksplant-reunoista voi olla merkittävää yli 7.14 päivää. Mekaaninen dissosiaatio voidaan yhdistää myös entsymaattiseen hoitoon solujen talteenoton parantamiseksi, erityisesti fibrokartilaatiosta tai kasvulevy rustosta.

Kasvutekijöiden käyttö ja molekyylien signaalien antaminen

Kun eristetyt kondrosyytit ja osteoblastit ovat erittäin tärkeitä proliferatiivisen kasvutekijän lisänä ja niiden fenotyypin ylläpitämiseksi, luiden morfogeeniset proteiinit (BMP-2, BMP-7) ja transformoiva kasvutekijä-beeta (TGF-β, erityisesti TGF-β1 ja TGF-β3) ovat välttämättömiä kuona- ja osteogeneesin edistämiseksi. Fibroblast kasvutekijä-2 (FGF-2) ja insuliinin kaltainen kasvutekijä-I (IGF-I) ovat usein lisättäneet ne proliferaation lisäämiseksi ja viivästyttämiseksi, deksametasoni (10....100 nM), askorbiinihappo (50 μg/mL) ja beeta-glyserofosfaatti (10 mM) ovat vakiokomponentteja tukemaan matriisin mineraalisaatiota.

Optimoidaan kulttuurimediaa ja lisäravinteita

Soluviljelmän keskikoko vaikuttaa suoraan solujen käyttäytymiseen. Kondrosyyttien osalta korkean verensokerisen Dulbecco. DMEM-taudissa on kriittinen vaikutus; joidenkin laboratorioiden käyttämä seerumi on 20%:n luokkaa, kun ensimmäinen vaihe on tehty heikosti tuottavien näytteiden kiinnittämisen parantamiseksi. Antibiootit (penisilliini-streptomysiini) ja sienilääkkeet (amphoterisiini B) on lisätty estrogeenisten vaikutusten välttämiseksi alkueristyksen aikana, mutta niiden on oltava asteittain pienennettyjä, kun viljelmät on vahvistettu sytotoksisuuden vähentämiseksi. pH-indikaattori (fenolipuna) sisältyy visuaaliseen seurantaan, mutta herkissä kokeissa, fenoli-puna-aine-vapaat valmisteet ovat suositeltavia estrogeenisiä vaikutuksia vastaan.

3D-kulttuurijärjestelmät ja -alustat

Kaksiulotteinen monokerrosviljely voi aiheuttaa kondrosyyttien dediterktion (kollageeni II:n ja aggrekaanin ekspression menetys) ja osteoblastien litistämisen. Kolmiulotteisia järjestelmiä käytetään usein fenotyypin ylläpitämiseen. Kolmiulotteisia järjestelmiä käytetään paremmin jäljittelemään kollageenin mikroympäristöä. Pellettiviljelmät (keskittyneet soluaggregaatit), mikromassaviljelmät ja hydrogeelien kapselointi (agaroosi, alginaatti, kollageeni tai hyaluronihappo) antavat syklistä puristusta tai nestestrippausta käyttäville bioreagoijille rakenteellista tukea ja osteojohtavia cues-malleja. Nämä kehittyneet kulttuurimallit ovat välttämättömiä matriisin tuotannon ja solujen linjauksen tutkimisessa ja kudos-muokkauksen kehittämisessä.

Erillisten solujen laadunvalvonta ja luonnehdinta

Eristyksen ja viljelyn jälkeen on välttämätöntä tarkistaa solujen identiteetti ja puhtaus. Kondrosyyttien osalta positiivisia merkkejä ovat kollageeni tyyppi II, aggrecan, SOX9 ja ruston oligomeerinen matriisiproteiini (COMP). Osteoblastin markkereita ovat Runx2, osrix, alkalisen fosfataasin ja osteokalsiinin. Virtaussytometria, määrällinen PCR ja immunofluoresenssi ovat standardimenetelmiä. Elinkelpoisuutta on arvioitava uudelleen jokaisen siirron jälkeen; lasku alle 70% osoittaa stressiä. Karyotyping voi seurata kromosomien vakautta pitkittyneen laajentumisen aikana. Lisäksi toiminnalliset määritykset. Kuten alkialainen sininen tahrautuminen kronoglykaanien kronosyyttipelleteissä tai alitariin punainen tahrautuminen kalsiumin kertymistä osteoblastiviljelmissä. Vahvista, että solut säilyttävät erikoisuutensa.

Yleiset jäljet ja vianmääritys

Monia kysymyksiä ilmenee usein, kun soluja viljellään rustosta ja luusta.Hittosolun tuotto[] voidaan ratkaista pidentämällä ruoansulatusaikaa (turvallisissa rajoissa), käyttämällä tuoretta entsyymiä tai yhdistämällä entsymaattiset ja eksplanttiset menetelmät. Kondrosyyttien erilaisuus [[]] on usein merkkinä siirtymisestä polygonaalista fibroblastiseen morfologiaan.

Tulevaisuuden linjaukset ja kehittyvät teknologiat

Äskettäin saavutetut edistysaskeleet työntävät rajoja, jotka voidaan saavuttaa niukoista solukannoista peräisin olevilla luustokudoksilla. Yksisoluiset RNA-sekvensointi on paljastanut odottamattoman heterogeenisyyden kondrosyyttien ja steosyyttien välillä, mahdollistaen kohdennetummat kulttuuristrategiat. Organoidi- ja mikrokudosmalleja, jotka yhdistävät useita solutyyppejä (krondrosyyttejä, osteoblastit, endoteelisolut) kehitetään tutkimaan osteoartriittia ja luun korjausta. Mikrofluidialustat mahdollistavat luun ja rustoexplanttojen perfuusiokulttuurin, joka ylläpitää elinkelpoisuutta viikkoja. Gene-edifikaatiotyökaluja, kuten CRISPR-Casin9, voidaan ottaa käyttöön rajattomassa solulähteessä tutkimukseen ja hoitoon. Nämä innovaatiot lupaavat voittamaan monet primaarisolukulttuuriin liittyvät rajoitukset, jotka johtuvat haastavista kudoksista. Lisäksi indusoituja plupotentteja kantasoluja (i PSC) ohjataan kohti kronogeneettisia ja osteogeenisia linoja, jotka tarjoavat rajattoman solun lähden tutkimukseen ja hoitoon.

Päätelmät

Onnistuneesti viljelevät solut rustosta ja luusta vaativat monipuolista lähestymistapaa, jossa kunnioitetaan näiden kudosten ainutlaatuista biologiaa. Huolellinen valinta entsymaattisen ruoansulatusprotokollia, kalkkeutumismenetelmiä, kasvutekijäcocktaileja ja kulttuurialustoja parantaa merkittävästi solujen tuottoa ja fenotyyppistä vakautta. Kiinteiden laadun valvonta varmistaa, että jatkosovelluksissa käytetyt solut ovat aitoja ja toimivia. Hyväksymällä nämä strategiat tutkijat voivat avata luustosolumallien mahdollisuudet edistää regeneratiivisen lääketieteen, lääketestauksen ja tuki- ja liikuntaelinten sairauksien perustason ymmärtämistä. Jatkoinnovoinnin 3D-kulttuurissa, orgaan-on-sirujärjestelmissä ja kantasoluteknologiassa laajentaa entisestään kykyämme tutkia näitä haastavia, vielä elintärkeitä kudoksia [Curr. Osteoporos. Rep.] .

Ks. yksityiskohtaiset protokollat entsymaattisesta mädätyksestä Luonnonprotokollat; kasvutekijän ohjeet, ks. Kantasolut Käännöslääketiede[; ja kalkkeutumistekniikoiden osalta ks. []PubMed-indeksin menetelmät[].