The Biology of Cellular Senescence

Pitkän aikavälin soluviljelmät muodostavat selkäranka lukemattomia kokeita huumelöydöksen, toksikologian, regeneratiivisen lääketieteen, ja perusbiologian. Kuitenkin kaikki jatkuvat linjat lopulta edessä peruseste: solujen senescence. Senescence on vakaa pidätys solujen proliferaation, joka tapahtuu vastauksena eri sisäisiä ja extrinsic stressiä. Toisin kuin vaisto, joka voidaan kääntää, sensenttisolut pysyvät metabolisesti aktiivisia mutta pysyvästi lopettaa jakaminen. Tämä tila muuttaa geenin ilmentymistä, erittää pro-inflammatorinen mileeu tunnetaan senescence-sidonnainen secretory fenotype (SASP), ja voi sekoittaa kokeellisia tietoja tai pysäyttää bioprosessien tuotantoa. Ymmärtäminen laukaisimet ja polut senescence on ensimmäinen askel kohti kehittää kestäviä strategioita estää sitä.

Sensencen avainlaukaisimet ja kulkuväylät

Telomeerin lyhentäminen ja replikoiva senescence

Jokainen DNA-replikaatiokierros lyhentää telomeerien suojakorkkia kromosomin lopussa. Kun telomeerit lyhenevät kriittisesti, DNA-vauriovaste (DDR) aktivoi p53 ja p21, mikä johtaa pysyvään solun syklin pysähtymiseen. Tämä replikoiva sensessi on luonnollinen raja useimmille ihmisen somaattisille soluille, joilla ei ole riittävää telomeeritoimintaa. Kulttuurissa telomeerien eroosio kiihtyy suboptimaalisissa olosuhteissa, jolloin telomeerien ylläpito on ensisijainen tavoite proliferatiivisen eliniän pidentämiselle.

Oncogene-induced senseence (OIS)

Onkogeenien, kuten ]RAS[] tai ]BRAF[], aktivoiminen voi laukaista senessenssin p16[]]INK4a[[]/RB-reitin kautta. Kulttuurissa oncogenien vahingossa tapahtuva aktivointi (esim. spontaanien mutaatioiden kautta) voi pysäyttää laajentumisen. OIS toimii kasvainta vähentävänä mekanismina, mutta se ei ole toivottavaa, kun tarvitaan yhtenäistä, nopeaa kasvua edistävää kulttuuria.

Hapettavat stressi ja DNA-vauriot

Reaktiivinen happilaji (ROS) normaalista aineenvaihdunta- tai viljelyolosuhteista (esim. korkea happijännitys, valoaltistus) aiheuttaa DNA-leesioita, proteiinin hapettumista ja lipidiperoksidaatiota. Jatkuva oksidaatiovaurio aktivoi DDR:n ja p53:n, ajaa ennenaikaista senesenssiä. Normaalit hautomot ilmakehän happea (~20%) aiheuttavat suuremman hapettumispaineen kuin fysiologiset tasot (1.155%), kiihdyttävät sensenssin monissa solutyypeissä.

Epigeneettinen sääntelyn purkaminen

Histonemodaatiot ja DNA-metylaatiomallit muuttuvat viljelyiän myötä. Heterokromatiinimerkkien menetys, kehitysgeenien uudelleen ilmentyminen ja muuttunut kromaattien reformointi voivat aktivoida senescence-reitit telomeerin pituudesta riippumatta. Epigeneettinen epävakaus kertyy ajan mittaan ja sitä pahentaa riittämätön kulttuurimedia.

Strategiat etääntymisen ehkäisemiseksi pitkäaikaisissa kulttuuriympäristöissä

1. Telomeraasiaktivointi ja hTERT-ilmaisu

Suoraan välttää replikatiivisen senessenssi on palauttaa teglomeraasitoiminnan. Monet solutyypit.mukaan lukien primaariset fibroblastit, epiteelisolut ja mesenkykaaliset kantasolut voidaan kuolematon teglomeraasi (hTERT).Tämä lähestymistapa ylläpitää teglomeraasipituuden yli satojen populaation kaksinkertaistumisten, jos muut kulttuuriolosuhteet optimoidaan. hTERT-ilmaisu ei aiheuta muutosta itsestään; se yksinkertaisesti laajentaa proliferatiivista rajaa. Tutkijat käyttävät usein lensiviraalisia tai retrovirusvektoreja toimittaakseen hTERT-arvon, mutta huolellinen validointi on tarpeen kloonaaamisen välttämiseksi. Esimerkiksi kattava tarkastelu Luontoarvostelut Molecular Cell Biology[]]

2. Optimointi kulttuuriolosuhteet

Jokainen in vitro -ympäristön parametri vaikuttaa sensenssin alkamiseen. Seuraavat muutokset ovat osoittautuneet tehokkaiksi:

  • Happijännitys on vähäistä.[] Kasvatussolut 2...5% O2:ssa (normoxia useimmissa kudoksissa) vähentävät ROS-tuotantoa, vakauttavat hypoksian induktoivia tekijöitä ja viivästyttävät senesenssiä. Monet kantasolut ja ensisijaiset linjat pidentävät merkittävästi niiden elinaikaa hypoksisissa olosuhteissa.
  • Antioksidanttilisä.[ Lisäämällä yhdisteitä, kuten N-asetyylikysteiini, E-vitamiini tai glutationin esiasteet, voi rikkautta ROS ja suojella telomeerit. Kuitenkin liian suuret annokset voivat olla myrkyllisiä; titraus on välttämätöntä.
  • Korkealaatuinen media ja seerumi.[[] Tuoreen, endotoksiinivapaan median käyttö optimoiduilla glukoosi-, glutamiini- ja pyruvaattipitoisuuksilla vähentää aineenvaihduntaa. Sikiön seerumin (FBS) erän vaihtelut vaikuttavat sensenssiin; määriteltyjen seerumittomien valmisteiden tai vähärasvaisten pyruvaattien käyttö voi parantaa toistettavuutta.
  • phH:n ja osmolaalisuuden valvonta.[] Usein keskikokoiset muutokset, joissa on tiukka bikarbonaattipuskuri (käyttäen HEPES-kaasua CO2-hautomoiden ulkopuolella), estävät happamoitumisen ja osmoottiset iskut, jotka aiheuttavat pysähdyksen.
  • Kaasupinnoitteet ja solunulkoinen matriisi.[] Sensaatio viivästyy, kun soluja kasvatetaan substraateilla, jotka jäljittelevät niiden alkuperäistä ympäristöä. Esimerkiksi solupudotetulla matriksilla viljellyt mesenkymaattiset kantasolut pitävät yllä suurempaa proliferatiivista kapasiteettia kuin muovilla.

Yksityiskohtaisen protokollan osalta, joka koskee pitkäaikaisten jaksojen viljelyolosuhteiden optimointia, Current Protocols in Cell Biology guideline tarjoaa käytännön vertailukohtia.

3. Geneettinen muuntaminen teleomeraasia pidemmälle

Vaikka hTERT on yleisin kuolemattomuusväline, muut geneettiset toimenpiteet voivat torjua senescence kautta toisiaan täydentäviä reittejä:

  • ] Antisenessenssigeenien yli-ilmentyminen.[ ]BMI1[[] (B-soluspesifinen molonileuremiaviruksen integraatiosivusto 1) respressoi []INK4a[]/[]]ARF[ lokuksen, joka vähentää p16[]] INK4a[[]]-ilmaisua. [[SV40 isoa T-antigeeniä[[] inaktivoi sekä p53 että retinoblastoomaproteiinia (RB), joka tehokkaasti ohittaa senescencen monissa fibroblastilinjoissa. Kuitenkin SV40 T-antigeeni voi johtaa genomiseen epävakauteen ja soveltuu enemmän tilapäiseen imalistumiseen.
  • ]Synkeilyyn liittyvien geenien tuhoaminen.[] Hiljentäminen p21[ tai p16[]] käyttäen shRNA:ta tai CRISPR-i:tä voi vapauttaa soluja pysähdyksestä. Tätä lähestymistapaa on käytettävä varoen, koska se voi lisätä muutoksen riskiä.
  • CRISPR/Cas9-pohjaiset lähestymistavat.[[] Telomeerien promoottorien tarkka muokkaus tai telomeeriin liittyvien vaurioreittien korjaaminen on nyt mahdollista. Esimerkiksi ATM[]kinaasin häiritseminen voi kumota DNA-vaurion tarkastuspisteen, mikä mahdollistaa jatkuvan jakautumisen lyhyistä telomeeristä huolimatta, mutta genomivakauden kustannuksella. Tasapainoisimmissa strategioissa yhdistyvät teglomeraasin uudelleenaktivaatio ja p53-reittimodulointi.

4. Pienet molekyylisenolyyttiset ja senescence Reversal

Sen sijaan, että estettäisiin senesenssi, jotkut yhdisteet voivat valikoivasti poistaa senessenssisoluja tai estää SASP. Nämä ovat vähemmän hyödyllisiä ylläpitää proliferatiivinen kulttuuri, koska ne puhdistaa pidätetyt solut mutta eivät palauta kasvua. Kuitenkin, kun yhdistettynä ennakkoasennuksiin, ne voivat parantaa yleistä kulttuuri terveyttä:

  • Dasatinibi + quercetiini.[] Tämä yhdistelmä vähentää senessenttisolutaakkaa in vivo ja in vitro, mutta se on sytotoksista joillekin primaariviljelmille.
  • Rapamysiini.[] Estämällä mTOR:ia rapamysiini viivästyttää sensenssiä useissa solutyypeissä, vähentää SASP:tä ja parantaa autofagia. Se ei estä suoraan telomeerin lyhenemistä, vaan lykkää muiden senessenssin tunnusmerkkien syntymistä.
  • Metformiini.[ Tunnettu anti-aging vaikutuksistaan, metformiini vähentää mitokondrion ROS:ää ja aktivoi AMPK:n, mikä hidastaa senesenssiä mesenkymalia kantasoluissa ja endoteelien kantasoluissa.
  • Resveratrol ja nikotiiniamidi ribosidi.[ Nämä NAD+:n lähtöaineet lisäävät sirtuiiniaktiivisuutta, joka voi ylläpitää heterokromatiinia ja viivästyttää epigeneettistä sensenssiä.

Kattava yleiskatsaus senoterapeuttisista yhdisteistä on tässä [Cell katsauksessa senessenssi-kohde-huumeet.

Pitkän aikavälin kulttuurien käytännön päivittäinen hallinta

Myös optimoiduissa olosuhteissa ja geneettisissä työkaluissa päivittäinen käsittely määrittää, pidetäänkö sen jälkeen erillään. Seuraavat toimintaohjeet auttavat ylläpitämään vankkoja kulttuureja:

  • Limit-väylän numero.[] Ensisijaisten linjojen osalta kryovarastoikaa varhaiset käytävät ja laajenna vain tarpeen mukaan. Käytä kulkureittiä (kumulatiivinen populaatio kaksinkertaistuu, ei vain kulkunumero) seurataksesi elinkaarta.
  • Vältä ylikonfluenssaa.[] Kontaktin esto ja ravinnevaje konfluenssassa aiheuttavat hämmennystä ja senesenssiä. Alakulttuuri, kun solut saavuttavat 70.80% konfluenssia, ei sen enempää.
  • Käytä hellävaraisia dissosiaatiomenetelmiä.[] Trypsiini/EDTA-altistuksen tulisi olla minimaalinen. Harkitse krataasi- tai ei-entsymaattisen dissosiaatiopuskurien käyttöä herkille soluille. Pitkäaikainen trypsinointi vahingoittaa pintareseptoreja ja laukaisee stressin vasteita.
  • Monitor stressimarkkerit.[] Rutiinivärjäys senessenssiin liittyvän β-galaktosidaasin (SA-β-gal) tai qPCR:n osalta p21[] ja [] p16[[]] voivat havaita varhaisia merkkejä.
  • Cryopreservation best practices.[ Käytä elinkykyisiä jäädytysvälineitä (esim. 10% DMSO + 90% FBS), säädeltyä kylmää tai isopropanolia sisältävät säiliöt ja säilytä nestemäisessä typpihöyryfaasissa. Elinkelpoinen sulatus ilman DMSO-myrkyllisyyttä on erittäin tärkeää.
  • ]Lepakon testiseerumi ja media.[[] Ennen kuin sitoudut uuteen osaan, suorita kasvukäyrä 3.15 kohdan yli, jotta voidaan verrata kaksinkertaistamisaikoja ja senessenssien ilmaantuvuutta.

Tulevat Suunnat: Seuraavan sukupolven lähestymistavat

Kenttä on siirtymässä perinteisestä 2D-yksikerroksisesta kulttuurista. Kolmiulotteisilla järjestelmillä, kuten orgaanisilla organismeilla, pallomaisilla ja bioreaktorisilla viljelmillä, on usein viivästynyt senesanssi, koska ne jäljittelevät paremmin in vivo -arkkitehtuuria ja ravinnegradientteja. Mikronestemäisillä perfuusiolaitteilla voidaan poistaa jätettä ja toimittaa tuoretta ainetta jatkuvasti, mikä vähentää stressiä. Lisäksi indusoitujen pluripotenttisten kantasolujen (IPK) omatoimisuus on rajatonta ja ne voidaan eriyttää halutuiksi somaattisiksi soluiksi, tehokkaasti sivuuttaa lähtölinjan senessenssi. IPTK-teknologian yhdistäminen ohjattuun erilaistumiseen ja epigeneettiseen nuorentamiseen voi pian tarjota ehtymättömiä lähteitä ei-senttisille soluille tutkimusta ja hoitoa varten.

Toinen jännittävä suunta on käyttää ohimenevää ilmentymistä Yamanaka tekijät (OCT4, Sox2, Klf4, c-Myc) osittain uudelleenohjelmointi soluja, palauttaa epigeneettisen iän ilman pyyhkimistä identiteettiä. Tutkimukset fibroblastit ovat osoittaneet, että lyhyt, syklinen ilmentyminen nämä tekijät vähentää senescence merkkejä ja pidentää replikatiivisen eliniän. Tämä ...epigeneettinen nuorentaminen. Lähestymistapa on vielä kehitteillä, mutta tarjoaa ei-geneettisen vaihtoehdon telomeerisoimaton.

Päätelmä

Estämällä senesanssia pitkäaikaisissa soluviljelmissä tarvitaan teglomere biologiaa, hapettavaa stressiä, kulttuuriympäristöä ja geneettistä vakautta koskeva kerrostettu strategia. Yksikään yksittäinen ratkaisu ei toimi yleisesti; parhaat tulokset saadaan yhdistämällä telomeraasiaktivaatio (hTERT) optimoituihin matala-hapen olosuhteisiin, korkealaatuisiin tiedotusvälineisiin, lempeään käsittelyyn ja säännölliseen seurantaan. Tutkijoiden on harkittava solujen loppukäyttöä riippumatta siitä, onko kyse toiminnallisista määrityksistä, biotuotannosta tai elinsiirroista. Integroimalla nämä tekniikat voidaan ylläpitää terveellisiä, proliferatiivisia kulttuureja satojen väestön kaksinkertaistuessa, varmistaa toistettavissa olevat ja mielekkäät kokeelliset tulokset.