Nykyaikainen geneettinen tutkimus on tullut transformatiivinen aikakausi, joka perustuu tarkkuuden geenimuokkaustyökalujen kehittämiseen. Näitä uraauurtavia teknologioita ovat Talens (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) ja ZFNs (Zinc Finger Nucleases) erottuvat perusalustoina, jotka mahdollistavat kohdennetun DNA-muuntamisen kauan ennen CRISPR-vallankumousta. Nämä suunnitellut proteiinit mahdollistavat tutkijoiden käyttöön kaksois-teräksen taukoja määritellyissä genomipaikoissa, vipuvaikutuksen soluihin luontaiset korjausreitit.No-homologous end accessing (NHEJ) tai homology-ohjatut korjaus (HDR) . Niiden vaikutus ulottuu lääketieteen, maatalouden ja perusbiologisen tutkimuksen välillä ja ne ovat välttämättömiä sovelluksissa, joissa vaaditaan korkea spesifisyys tai pieniä kohdejaksoja.

Talenien ja ZFN:ien järjestelmien ymmärtäminen

Sinkkisormen Nucleuss: Modular DNA Recognition

ZFN:t olivat ensimmäiset 1990-luvun puolivälissä kuvatut ohjelmoitavat nucleases-divisioonat. Jokainen ZFN:n muodostavat DNA:ta sitovan verkkotunnuksen, joka on koottu sinkkisormen proteiineista ja DNA-sellun verkkotunnuksesta, joka on johdettu FoKI[-rajoituksesta. Yksittäisten sinkkisormien modulit tyypillisesti tunnistavat kolmen nukleotidisekvenssin. Kun tutkijat yhdistävät useita sormia toisiinsa, he voivat kohdistaa sekvenssejä 9-18-kantaparin välillä. Koska Foki[[]:n on dimerisoitava leikkaamaan DNA:ta merkittävästi, kaksi ZFN:a on suunniteltu sitomaan vastakkaisia säikeitä kohdesivustosta, jotta niiden pilkkomisalueet yhdistyisivät avaruuden yli.

Sinkkisormien suunnittelu ja kokoonpano voi olla teknisesti haastavaa kontekstista riippuvaisten affiniteettien .Sinkkisormen tunnistamiseen voivat vaikuttaa myös viereiset sormet. Kuitenkin menetelmät, kuten OPEN (Oligomerized Pool Engineering) ja kontekstista riippuvainen kokoonpano, ovat parantaneet ennustettavuutta. ZFN:iä on käytetty tyrmäyssolulinjojen luomiseen, transgeenisten eläinmallien luomiseen ja sairauden aiheuttamiin mutaatioihin varhaisissa kliinisissä tutkimuksissa.

Transkriptio Aktivoija-Ike Effector Nucleases: Single-Nucleotidi Specificity

TALENit syntyivät noin 2009.2010 vaihtoehtona yksinkertaisemmilla muotoilusäännöillä. DNA:ta sitova verkkotunnus tulee transkriptioaktivaattorin kaltaisista efekteistä (TALE), kasvipatogeenin erittämiä proteiineja Xantomonas[]. Jokainen TALE-moduuli tunnistaa täsmälleen yhden nukleotidin, joka määritetään kahdella hypervariable aminohappojäännöksellä, jotka tunnetaan toistuvana dijäämänä (RVD). Yleisimmät RVD.nukleotidiparit ovat adeniini NI, sytosiini HD, tymiini NG (tai NK, jos kyseessä on korkeampi spesifisyys). Järjestämällä nämä moduulit järjestyksessä, TALEN voi kohdistaa ne virtuaalisesti mihin tahansa DNA-sekvenssiin.

TALENit käyttävät myös ]Foki[] pilkkoutumisaluetta ja vaativat parisidontaa leikkaamiseen. TALE-toistorakenteiden kokoonpano voidaan saavuttaa käyttämällä Golden Gate -kloonausta tai kiinteävaiheista synteesiä. TALEN-aineilla on yleensä korkeampi spesifisyys kuin ZFN-arvoilla ja pienempi toksisuus soluissa, vaikka niiden suuri koko (~3 kb per monomeeri) voi rajoittaa virusvektorin toimittamista. Niitä on kuitenkin onnistuneesti sovellettu seeprakala-, rotta-, sika- ja ihmissolulinjoissa sekä useissa prekliinisissä geeniterapiatutkimuksissa.

Historiallinen kehitys ja välitavoitteet

Vuonna 1996 Chandrasegaran ja kollegat fuusioivat kolmen sinkin verkkotunnuksen .Foki, loivat ensimmäisen ZFN. Tämä läpimurto mahdollisti kohdegenomi editointi []Drosophila ja myöhemmin ihmisen soluissa. Vuoteen 2005 mennessä ZFN:iä oli käytetty muuttamaan ]CCR5[] geeniä antamaan HIV-resistenssiä, käsite, joka myöhemmin tuli kliinisiin tutkimuksiin. ZF-728-T-tutkimus (Sangamo Therapeutics) käytti ZFN:iä hajottamaan .

TALEN-teknologia kehittyi nopeasti TALE-proteiinien rakenteellisen selkeytymisen jälkeen vuonna 2007. Kolmen vuoden kuluessa useat ryhmät ilmoittivat toiminnallisesti TALEN-geenien editointia hiivassa, kasveissa ja ihmissoluissa. Niiden yksinkertaisuus laski akateemisten laboratorioiden genomieditointia koskevaa estettä, joka käynnisti löytöaallon. Vuoteen 2012 mennessä TALEN-konsertteja käytettiin luomaan ensimmäiset geenieditoidut siat sairauksien mallintamiseen ja ksenotransplantaatiotutkimukseen. Kim ja Kim (2014) -tutkimus :]Luontoarvostelut Genetiikka[[ kertoo molempien teknologioiden rinnakkaisesta kehityksestä.

Sovellukset nykyaikaisessa tutkimuksessa

Lääketieteellinen tutkimus ja geeniterapia

ZFN:illä ja TALEN:illä on pitkälle edennyt geenihoito monogeenisten häiriöiden hoitoon. Sirppisolusairauksissa ja beeta-talassemiassa ZFN:illä BCL11A[]:n erytroidin tehostajana on käytetty [:n]:n punasolujen reaktivointia sikiön hemoglobiinin ilmentymisen yhteydessä. Vaiheessa 1/2 kliinisessä tutkimuksessa (NCT03282656) ZFN:n käyttö hematopoieettisten kantasolujen eks vivo muokkaamiseen on osoittanut, että hemoglobin paraneminen on jatkunut. TALEN:iä on käytetty korjaamaan []:n [IL2RG[]:n geeni X-sidonnainen vaikea immuunikato (SCID-X1) potilassoluissa, ja korjattuja soluja, jotka osoittavat toiminnallista revalvointia hiirimalleissa.

Maatalousbiotekniikka

Kasvien parannuksessa on käytetty taleneja ja ZFN-kasveja torjunta-aineille vastustuskykyisten ja tauteja sietävien lajikkeiden luomiseen.Ensimmäinen kaupan pidetty Talen-edited-kasvi.Calyxt kehitti soijaa öljyprofiilinsa parantamiseksi.Vuonna 2019 julkaistiin ZFN-kasveja, joiden avulla on lisätty riisin satoa tyrmäten viljakokoisia negatiivisia säätimiä.Näiden nukkelistojen suuri spesifisyys vähentää tahattomia genomimuutoksia, mikä on eduksi genomitekniikan sääntelylle.]Joungin ja Sanderin (2013) yksityiskohtaista analyysia Luontobion[) kasvigenominologiassa tarkastellaan TALENien soveltamista.

Toiminnallinen genomiikka ja malliorganisaatiot

Molemmat alustat ovat mahdollistaneet systemaattiset geenien tyrmäystutkimukset lajeilla, joilla alkion kantasoluja ei ollut saatavilla. Seebrakalassa Taleneja käytettiin luomaan >200 kohdennettua mutanttia yhdessä yhteenliittymässä, paljastaen geenitoiminnot kehityksessä ja sairauksissa. Rotilla ZFN:t häiritsivät [] p53[]] kasvaimensuppressoria syöpämallien luomiseen. Kyky tuottaa tarkkoja pistemutaatioita HDR:n avulla käyttäen yksisiivisiä oligonukleotidin luovuttajia on laajentanut koputus-in-mallien repertoaaria hermoston rappeutumis- ja sydänsairauksien osalta. Tutkijat ovat myös yhdistäneet TALEN-soluja ehdollisen ilmentymisjärjestelmän kanssa kudos-spesifisen editointijärjestelmän saavuttamiseksi.

Verrattuna CRISPR-Ca-Ca-arvoihin9

CRISPR-Cas9 (2012) -proteiinipohjaisen DNA:n tunnistaminen ei perustu ohjeeseen RNA, jolloin RNA-välitteisten off-tegage -vaikutusten riski poistuisi. Lisäksi ZFN- ja Talen-virusten spesifisyys on suurempi, kun CRISPR-kohdentaminen on toistuvaa tai GC-rikasta aluetta. Näiden rakennelmien suurempi koko (~4...10 kb) voidaan pakata adeno-liitännäisvirukseen (AAV) ja siihen liittyviin vektoreihin, joiden käyttö on vaikeaa, mutta kaksi-vektoristrategioihin ja mini-TALEN-malleihin on optimoitu.

Merkittävä rajoitus on uusien ZFN- tai TALEN-laitteiden suunnittelussa tarvittava kustannus ja työ. CRISPR vaatii vain 20-bp:n ohjesarjan uudelleensuunnittelua, ZFN ja TALEN-synteesi vaatii proteiinien verkkotunnusten kokoamista ja validointia. Myös kohdeiden ulkopuolinen pilkkominen on huolenaihe; sinkkisormien rakenne voi sietää yhteensopimattomuutta ja Talen-laitteet voivat leikata osittain kohdesivustoilla. Kattava off-table profilointi käyttäen menetelmiä kuten Guide-Seq tai CIRCLE-Seq on välttämätön kliinisen kääntämisen ja toimitusprofiilien kannalta. A 2017-tarkistus Biotekniikan rendeistä[] [] on näiden kolmen nukleaatin fideellisyys ja toimitusprofiilien vastakohta.

Tulevat suuntaviivat ja meneillään olevat parannukset

Nykyisen tutkimuksen tavoitteena on lisätä Talenien ja ZFN:ien tehokkuutta ja turvallisuutta samalla kun tuotantokustannuksia alennetaan. Proteiinitekniikan kehitys on tuottanut ZFN:iä, joilla on parempi lämpövakaus ja vähentynyt sytotoksisuus. Rakenneohjattu -versioiden uudelleensuunnittelu (kuten ELD-KKKR ja Sharkey) parantaa dimerointispesifisyyttä ja katalyyttistä toimintaa. TALENien koneoppimisalgoritmit ennustavat nyt optimaaliset RVD-yhdistelmät haastaviin kohteisiin ja korkean läpimenotason kultaporttien kloonaus mahdollistaa matriisien valmistuksen yhtenä päivänä.

Toimituksen pullonkaula in vivo -sovelluksissa.Hippahappo-nanopartikkelit ja adeno-liitännäiset virusvektorit on jalostettu hematopoieettisille kantasoluille ja maksasoluille. ZFN/TALEN-proteiinien (eikä DNA:n) ohimenevä toimitus vähentää pitkittynyttä nukleoitumista ja muita kuin kohde-tapahtumia. Maataloudessa käytetään taleneja kehittämään sisgeenisiä kasveja, jotka tunkeutuvat luonnollisiin alleeleihin ilman vierasta DNA:ta. Sääntelyympäristö voi suosia näitä esi-CRISPR-työkaluja, koska ne ovat vakiintuneet turvallisuustiedot ja ennakkotapaus markkinoiden hyväksymiselle.

Lisäksi TALEN- tai ZFN-laitteiden yhdistäminen peruseditointiin tai ensieditointiin.Niikaaseihin eikä kaksoisonnettomuuteen tukeutuva teknologia - voisi laajentaa niiden hyödyllisyyttä. Esimerkiksi Zn-sormisidonnainen sytidiinideaminaasi voi suorittaa kohdennetun perusmuunnoksen ilman kaksoisonnettomuutta. [] Julkaistu ZFN-pohjaisessa CCR5[ -käsittely (Tebas et al., 2014, [] New England Journal of Medicine[[]] -tutkimuksessa kuvataan hoitopotentiaalia, joka jatkaa investointien tekemistä näihin klassisiin alustoihin.

Lopuksi, Talens ja ZFN ovat edelleen elintärkeitä geneettisen tutkimustyökalun laatikossa. Niiden erottuvat ominaisuudet.Modular DNA tunnistaa, korkea spesifisyys, ja vakiintunut turvallisuus. Tehdä niistä korvaamattomia tietyissä sovelluksissa, varsinkin kun RNA-pohjaiset työkalut eivät sovellu. Kun alalla edetään kohti tarkkuus lääketieteen ja kestävän maatalouden, nämä edelläkävijä nucleases jatkaa katalysoimaan löydöksiä, jotka parantavat ihmisten terveyttä ja elintarviketurvaa.