Biolääketieteellisessä tutkimuksessa 2D- ja 3D-soluviljelmien valinta voi vaikuttaa merkittävästi huumetestauksen ja -kehityksen tulokseen. Vaikka perinteiset 2D-viljelmät tarjoavat yksinkertaisuutta ja nopeutta, 3D-järjestelmät tarjoavat fysiologisesti merkityksellisemmän ympäristön, joka ennustaa paremmin, miten huumeet käyttäytyvät elävissä organismeissa. Tässä artikkelissa verrataan molempia lähestymistapoja, tutkien niiden vahvuuksia, rajoituksia ja sopivia sovelluksia, jotta tutkijat voivat valita optimaalisen mallin prekliinisiä tutkimuksiaan varten.

2D-soluviljelymallien ymmärtäminen

Kaksiulotteinen (2D) soluviljely on tavanomainen menetelmä solujen kasvattamiseksi tasaisilla, jäykillä pinnoilla, kuten muovisissa Petri-astioissa, monikuoppisissa levyissä tai lasiliukumäissä. Solut kiinnittyvät pintaan ja leviävät, muodostaen monokerin. Tämä tekniikka on ollut solubiologian selkäranka jo yli vuosisadan ajan, koska se on yksinkertainen, kustannusltaan alhainen ja yhteensopiva korkean läpiviennin seulontaalustojen kanssa. Yhteisiin substraatteja ovat kudosviljelyllä käsitelty polystyreeni ja lasi, joka on päällystetty solunulkoisella matriksilla (ECM) proteiineilla, kuten kollageenilla tai fibronektiinillä.

Edut 2D Mallit

  • Helppokäyttö ja suuri uusittavuus:[ Standardoidut protokollat ja kaupallisesti saatavilla olevat reagenssit tekevät 2D-viljelmistä yksinkertaisia laboratorioiden välille ja niiden välille.
  • Alhaisempi kustannus ja nopeampi asennus:[] Telineillä tai bioreaktoreissa ei tarvita erikoislaitteita, mikä vähentää sekä pääoma- että toimintakustannuksia.
  • Soveltuu korkea läpivientiseulontaan:[ 2D-viljelmät voidaan järjestellä 96-, 384- tai 1536-well-levyihin, jolloin voidaan automatisoida robottikäsittely ja testata nopeasti tuhansia yhdisteitä.
  • Suora mikroskooppinen havainto:[] Solut yhdessä tasossa on helppo kuvata ja analysoida morfologian, proliferaation ja proteiinin ilmentymän kannalta.

2D-mallien rajoitukset

  • Kudosten kaltainen arkkitehtuuri:[] Solut kasvavat luonnottoman tasaisiksi, jolloin in vivo -kudoksille tyypillinen kolmiulotteinen rakenne ja solukosketuskyky häviävät.
  • Muuttunut solun käyttäytyminen:[] Gene ilmentyminen, aineenvaihdunta ja lääkeherkkyys eroavat usein kehossa olevista. Esimerkiksi 2D-solut saattavat yliesiintyä tiettyjen reseptorien, jotka ovat vähemmän aktiivisia kasvaimissa.
  • Huono ennustaminen lääkkeen tehoa:[] Monet yhdisteet, jotka näyttävät tehokkailta 2D:ssä, eivät toimi eläinmalleissa tai kliinisissä tutkimuksissa, koska kulttuuri ei toista elinten tai kasvainten monimutkaista mikroympäristöä.
  • Ei voida tutkia hypoksiaa tai ravinnegradientteja:[] Litteässä monokerroksessa kaikilla soluilla on yhtäläinen pääsy happeen ja ravinteisiin, toisin kuin kiinteissä kudoksissa, joissa on diffuusiogradientteja.

Tutkitaan 3D-soluviljelymalleja

Kolmiulotteisilla (3D) soluviljelmillä pyritään luomaan solujen luonnollinen ympäristö siten, että ne voivat kasvaa tilamatriisissa. Tämä voidaan saavuttaa rakennustelineisiin perustuvilla järjestelmillä (esim. hydrogeelit, huokoiset telinet, soluton ECM) tai rakennustelineisiin perustuvilla järjestelmillä (esim. pallot, orgaaniset viljelmät, roikkuvat viljelmät).

3D-mallien edut

  • In vivo -olosuhteiden parempi jäljittely:[ 3D-solut muodostavat monimutkaisia rakenteita solu- ja solumatriisi-yhteisvaikutuksilla, jotka vaikuttavat niiden käyttäytymiseen. Esimerkiksi 3D- palloideissa olevat hepatosyytit säilyttävät sytokromi P450:n aktiivisuuden, mikä tekee niistä parempia maksatoksisia testejä varten.
  • Lääkevasteiden tarkempi kuvaus:[ Lääke lääkkeeksi pääsy, resistenssi ja teho voidaan arvioida olosuhteissa, jotka heijastavat kasvaimen mikroympäristöä, kuten hypoksiaa ja interstitiaalista painetta.
  • Hyöty solu- ja solumatriisi-vuorovaikutusten tutkimiseen:[ 3D-viljelmät mahdollistavat sen tutkimuksen, miten syöpäsolut tunkeutuvat ympäröiviin kudoksiin tai miten kantasolut eroavat toisistaan mekaanisiin vihjeihin reagoitaessa.
  • Luotetaan eläinkokeisiin:[ Ihmisestä johdetut 3D-mallit, kuten urut-on-a-sirualustat, voivat korvata joitakin eläinkokeita ja antaa ihmisille spesifistä tietoa.

3D-mallien rajoitukset

  • Korkeampi monimutkaisuus ja kustannukset:[ Scaffolds, hydrogels, ja erikoistuneet kulttuuri levyt ovat kalliimpia, ja toistettavissa olevien 3D-viljelmien luominen vaatii huolellista optimointia.
  • Pieni syöttö:[] Monet 3D-järjestelmät eivät ole helposti yhteensopivia automaattisen nesteenkäsittelyn ja kuvantamisen kanssa, mikä rajoittaa niiden käyttöä laaja-alaisessa seulonnassa.
  • Erikoislaitteet ja -osaaminen:[ tekniikat, kuten bioprinting, mikrofluidi ja pallonmuodostus vaativat koulutusta ja erityisiä välineitä (esim. bioreaktorit, konfokaaliset mikroskoopit).
  • Epäilty kuvantamisessa ja analysoinnissa:[[] Thicker 3D -rakenteet sirottavat valoa, vaativat kehittyneitä mikroskooppitekniikoita (fokusoivat, multifotoni) visualisoinnissa ja dissosiaatio yhden solun analyysiin voi muuttaa solutiloja.
  • Standardoinnin puute:[ Protokollat vaihtelevat suuresti laboratorioiden välillä, joten tutkimusten väliset vertailut ovat haastavia.

Vertailu 2D- ja 3D-viljelyjen kanssa huumetestausta varten

Molemmilla malleilla on erilliset roolit huumeiden kehittämisverkostossa, ja valinta riippuu erityiskysymyksistä ja tutkimuksen vaiheesta.

Korkean toksisuuden seulonta ja toksikologia

Suuret yhdistekirjastot on tarkoitus tutkia ensin 2D-viljelmillä, jotka ovat edelleen niiden nopeuden ja skaalautuvuuden vuoksi kultastandardi. 3D-malleja käytetään kuitenkin yhä useammin seulonnassa, jotta ne kelpuuttavat osumia fysiologisissa olosuhteissa. Toksisuustesteissä [OECD:n [ ohjeet ihon in vitro -syövyttävyydestä [ hyväksytään nyt 3D-rekonstruktioiksi ihmisen epidermis -malleja eläinkokeiden korvaajiksi.

Syöpätutkimus ja kemoterapia

3D-kasvaimen palloidit ovat paremmin toistaneet kiinteiden kasvainten kasvukinetiikkaa ja lääkeresistenssiä, mukaan lukien nekroottisten ytimen ja kitaravyöhykkeiden muodostuminen. Tutkimukset ovat osoittaneet, että monien kemoterapia-aineiden puoli-maximaalinen estopitoisuus (IC50) on merkitsevästi korkeampi 3D-viljelmissä kuin 2D-viljelmissä, mikä heijastaa solusolujen solusfäärien heikentynyttä tunkeutumista ja muuttunutta metaboliaa in vivo. Esimerkiksi -tieteellisissä raporteissa tehdyssä 2020-tutkimuksessa on korostettu, että munasarjasyöpäsolujen palloidit olivat vähemmän herkkiä sisplatiinille kuin niiden 2D-vasta-aineet , mikä korostaa 3D-mallien käytön merkitystä kliinisen vasteen ennustamisessa.

Henkilökohtaiset lääke- ja potilasmallit

Organoidit 3D-viljelmät, jotka on johdettu potilaan kudoksista ovat mullistavia tarkkuus onkologia. Ne säilyttävät alkuperäisen kasvaimen geneettiset ja fenotyyppiset ominaisuudet ja niitä voidaan käyttää testaamaan lääkeherkkyyttä potilaskohtaisesti. Toisin kuin 2D-solulinjat, jotka usein ajautuvat läpikulkujen, organoidit ylläpitävät vakaata lääkevastetta useita viikkoja, mikä mahdollistaa toiminnallinen tarkkuus lääketieteen.

Tekniset näkökohdat Mallin valinnassa

Solun lähde- ja kulttuuriolosuhteet

Sama solutyyppi voi käyttäytyä hyvin eri tavalla 2D:ssä verrattuna 3D:hen. Esimerkiksi primaariset maksasolut menettävät nopeasti maksaspesifisiä toimintoja 2D:ssä, mutta niitä voidaan ylläpitää viikkoja 3D-sfäärissä. Tutkijoiden on myös otettava huomioon happi- ja ravinnegradientit: 3D-viljelmissä diffuusion avulla solujen elinkyky rajataan noin 200-300 μm:iin pinnasta, mikä saattaa edellyttää bioreaktorien käyttöä suurempiin rakennelmiin.

Matrix- ja Scaffold-valinta

Yhteisiä rakennustelineitä ovat mm. MatrigelTM, kollageeni tyyppi I hydrogeelit, alginaatti ja synteettiset polymeerit. Jokaisessa on erilaisia mekaanisia ominaisuuksia (jännitys, elastisuus), jotka vaikuttavat solujen käyttäytymiseen. Esimerkiksi [ matriisijäykkyyden on osoitettu ajavan epiteeli-mesenkymaalista siirtymää syöpäsoluissa[, kriittinen prosessi etäpesäkkeissä, jota ei voida tutkia 2D-muovissa.

Testilukemat

Vakiopääteanalyysit (MTT, ATP bioluminescence) toimivat 3D-viljelmissä huolellisen optimoinnin jälkeen, mutta livesolukuvantaminen on haastavampaa. Tutkijoiden on ehkä investoitava konfokaaliseen mikroskopiaan tai valo-sheet-mikroskopiaan reaaliaikaista seurantaa varten. Lisäksi mRNA ja proteiinin uutto 3D-rakenteista voi olla tehotonta; 3D-viljelmille suunniteltuja kaupallisia pakkauksia on nyt saatavilla.

Tulevaisuuden Suunnat: Tuuletus 2D ja 3D

Mikronesteiden ja organ-on-a-chip -teknologian kehitys hämärtää 2D- ja 3D-tasojen välisiä linjoja. Näissä alustoissa yhdistetään usein 2D-monolayereja 3D-geelialueisiin, jotta voidaan luoda monitilamalleja, jotka simuloivat elinten ja elinten vuorovaikutusta. Lisäksi keinoälyä käytetään analysoimaan 2D-tason kuvantamistietoja, jotta voidaan ennustaa tuloksia, jotka muutoin edellyttäisivät 3D-viljelmiä, ja mahdollisesti alentaa kustannuksia säilyttäen samalla fysiologisen merkityksen.

Toinen nouseva suuntaus on 3D-biopainatuksen käyttö sellaisten toistettavien, verisuonittaisten kudosrakenteiden valmistukseen, jotka voidaan läpäisee lääkkeillä. Näissä järjestelmissä yhdistyvät 2D-pinnoitus ja 3D-kudosten arkkitehtuurinen monimutkaisuus, ja ne hyväksytään FDA:n kaltaisten virastojen sääntelyvaatimusten osalta.

Päätelmät

Mikään yksittäinen soluviljelymalli ei ole universaalisti parempi huumetesteissä. 2D-viljelmät ovat edelleen välttämättömiä varhaisessa vaiheessa tapahtuvassa seulonnassa, mekanistisissa perustutkimuksissa ja sovelluksissa, jotka vaativat paljon läpivientiä. 3D-viljelmät tarjoavat korvaamattomia etuja tutkimuksissa, jotka edellyttävät kudosta muistuttavaa arkkitehtuuria, pitkäaikaista ylläpitoa ja kliinisesti relevantteja lääkevasteita. Vahvimmat prekliiniset strategiat käyttävät usein molempia menetelmiä: 2D:n käyttäminen alkuvaiheen yhdistetriageen ja 3D:n validointiin ja syvempään mekanistiseen ymmärrykseen. Ymmärtämällä kunkin lähestymistavan vahvuudet ja heikkoudet tutkijat osaa suunnitella kokeita, jotka maksimoivat ennustavan tarkkuuden ja hallinnoivat kustannuksia ja monimutkaisuutta.