מבוא ל-Inner Culture Systems

ייצור ביוכימי תעשייתי עבר שינוי פרדיגמה עם אימוץ של מערכות תרבות רצופות.בניגוד לתסיסה מסורתית, שבו מיקרואורגניזמים גדלים בכלי דיסקרטיות וקצירים לאחר תקופה קבועה, מערכות רציפות לשמור על מצב קבוע על ידי האכלה של חומרים מזינים טריים כל הזמן והסרת מוצר בינוני ומוצרים. גישה זו מבטלת את זמן ההורד המשויך לניקוי, סטריליזציה, וזרימה בין אצילות, המאפשרת ללא הפרעה במשך שבועות או שבועות.

העיקרון הבסיסי מאחורי התרבות הרציונאלית הוא תחזוקה של תאים מיקרוביאליים בשלב צמיחה מאוזן - אקספוננציאלית או נייח - על ידי שליטה בקצב דילולציה. ב chemostat, שיעור הדילול נקבע על ידי המפעיל וקובע את קצב הצמיחה הספציפי של התרבות.הריכוז של חומרים מזינים מגבילים מכתיב את צפיפות האוכלוסייה.

מבחינה היסטורית, התרבות הרצינית הייתה הראשונה שהתורגמה בשנות החמישים על ידי מונוד ו נוביק, אבל יישום תעשייתי מעשי ששילמה עקב אתגרים הנדסיים.היום, התקדמות בטכנולוגיית החיישן, אוטומציה והנדסה גנטית להתגבר על רבים מהחסמים הללו, מה שהופך מערכות רציפות להשגה לייצור מגוון רחב של ביוכימיים, כולל אתנול, חומצות אורגניות, אנזים, אנטיביוטיקה, חלבונים טיפוליים.

« הקשר היסטורי ואבולוציה

הרעיון של תרבות מתמשכת צמח ממחקר מיקרוביולוגיה יסודית בשנת 1950, ז'אק מונוד הציג את המודל המתמטי המקשר את קצב הצמיחה המיקרוביאלית לריכוז תת-התחרר – המשוואה המונוד – שהפכה לבסיס התיאורטי לתכנון צ'אט. זמן קצר לאחר, נוביק וסמילארד בנו את הchet הראשון של העבודה, המוכיח כי החיידק יכול להיות נשמר במצב יציב ללא הגבלת זמן.

אימוץ תעשייתי, לעומת זאת, היה איטי.ביולוגיים המוקדמים לא היו בעלי שליטה מדויקת הדרושה למניעת שחיקה או זיהום. Batchation נשאר דומיננטי כי זה היה פשוט יותר ופחות הון-רגיש.משבר הנפט של שנות ה-70 עורר עניין בתוססת מתמשכת עבור דלק אתנול, אך בעיות טכניות כגון אי יציבות ויצירה מוגבלת של ביופילם.

בשנות ה-90 וה-2000 ראו התקדמות מחודשת עם התפתחות הטכנולוגיה האנליטית של תהליך חזק (PAT) ואלגוריתמי בקרה מתקדמים.המבוא של FLT:0automated sampling SystemssFLT:1 ו-FLT:2 חיישנים מטבולטים מקוונים FLT:3 אפשרו התאמות בזמן אמת של שיעורי ההזנת ו- pH, קריטי לשמירה על מצבים יציבים על פני זמן רב.

סוגים של מערכות תרבות רציפות

צ'רובאטים

ב- chemostat, שיעור הדילול (D) נקבע על ידי המפעיל ונשאר קבוע.שיעור הצמיחה הספציפי (μ) של האוכלוסייה המיקרוביאלית מתאמת ל- D תחת מצב יציב.ריכוז של הזין המגביל (למשל, גלוקוז, חנקן או פוספט) נשמר נמוך כדי לשלוט בקצב הצמיחה.

כיביטים תעשייתיים הם בדרך כלל מעוררים כורים עם כרכים עבודה החל ממספר ליטרים לאלף ליטרים.הם דורשים משאבות אמינות, קווי מזון סטריליים ומערכות הסרה רכה.יתרונות כוללים פשטות של שליטה וקנטינות מובנת היטב. Disadvantages כוללים פגיעות לזיהום ולצורך בחיישנים איכותיים.

Turbidostats

Turbidostats להשתמש בבדיקה אופטית כדי למדוד צפיפות תאים.כאשר צפיפות עולה על נקודת סטואו, שיעור הדילול עולה לשטוף תאים עודף; כאשר זה טיפות, שיעור הדילול יורד.לאה משוב זה שומר ריכוז ביומסה קבוע. Turbidostats הם מורכבים יותר מאשר cheats אבל יכול להתאים לשינויים בקצב צמיחה שעלול לגרום להפחתה בריכוז ביומסה שימושי במיוחד עבור תהליכים ספציפיים.

מערכות היברידיות ומתקדמים

מערכות תרבות רציונאליות משלבות לעיתים קרובות תכונות של שני צ'אטים וטרנדוסטטים, יחד עם לולאות בקרה נוספות לטמפרטורה, pH, חמצן מומס ורמת קצף.חלק מהמערכות משלבות את FLT:0perfusion CultureFLT:1, שבו מכשיר שימור תאים (למשל, מסנן או צנטריפוגה) חוזר למתקן בעוד מוצר ללא תאים.

גרסה נוספת היא הכור הנפץ:0 (המתפרע) עם מחזור מחדש של 1 (CSTR-Recycle), שבו חלק מהזרם המועט חוזר למתקן לאחר הפרדת המוצר.זה מגביר את צפיפות התאים ואת ריכוז המוצר, שיפור כלכלת הזרם.

טכנולוגיות מתקדמות נהיגה במערכות מודרניות

העשור האחרון ראה חידושים טרנספורמטיביים המתייחסים לחולשות המסורתיות של תרבות מתמשכת: סיכון זיהום, חוסר יציבות תהליכים וקנה מידה.

אוטומציה וניהול תהליכים מתקדם

ביולוגיים מודרניים מצוידים במערכות בקרה מבוזרות (DCS) 1FreaLT (DCS) המשלבות חיישנים עבור pH, טמפרטורה, חמצן מומס, פוטנציאל חמצון, וניתוח גזים. Proportional-integral-integral-derivative (PID) בקרים עדיין נפוצים, אך שליטה חיזויית (MPC) ולוגיקה מטושטשת יותר ויותר בשימוש כדי לטפל בדינמיקה של מוצרים לא-FDIFDID2thal-FID:

לדוגמה, בתסססתת אלנול מתמשכת, שיעור הזנה של הגלוקוז הספציפי יכול להיות מותאם על בסיס ריכוז אתנול מקוון נמדד על ידי גס chromatography.זה מונע הזנה יתר, אשר מוביל לעיכוב תת-קרקעי, ותחת הנקה, אשר מפחית את הפרודוקטיביות.

טכנולוגיית חיישן ומעבדת טכנולוגיה אנליטית (PAT)

חיישנים שאינם פולשניים, כגון ליד- infrared (NIR) spectroscopy ו-Raman spectrometry, לספק ניטור בזמן אמת של מספר אריות (למשל, לקטטה, אמוניה, מוצר) ללא הסרת דגימות.FLT:0In-situ בדיקות ביומסהF:1LT באמצעות capacitance או אופטית לאפשר צפיפות מדויקת של תאים מתקדמים (FDA) , אינטגרטיבית, אינטגרטיבית של מערכת תרופות מתקדמת.

חיישנים מיקרו-השפעהיים - מכשירים מעבדה-על-a-chip - ניתן להציב קוינט כדי למדוד ריכוזים מטאבולטיים עם רזולוציה גבוהה של זמן.חיישנים אלה מאפשרים משוב מהיר וגילוי תקלות, להפחית את הסיכון של ייצור ארוך-טווח.

שילוב עם Downstream

(הופנה מהדף ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇

לדוגמה, מערכת תרבות רציפה המייצרת אנזים סודי יכול להאכיל ישירות לתוך יחידת סינון זרימה טנטנטית אשר מבהירה את המרק, ואחריו עמודה לוכדת רציפה.התהליך כולו פועל 24/7, מקצר באופן דרמטי את זמן הייצור בהשוואה לעיבוד אצווה.

Microfluidic ו-Miniaturized Systems

(החומרים המיקרו-אפקטיים, עם כרכים של ערוצים בטווח המיקרוליטר, מאפשרים טיפוח מקביל של מאות זנים בתנאים זהים או משתנים.מערכות אלה משמשים עבור FLT:0-High-puter סינון ( 1:1 של זנים מיקרוביאליים מהונדסים ולמען פרמטרים מכוונים לפני הגדלה.

חברות כמו FLT:0 synBioBetaFIRLT:1 מדגישות סטארט-אפים המשתמשים במכשירים מיקרו-השפעהיים כדי להאיץ את התפתחות המתח עבור עיבוד ביו-תרגול מתמשך.הנתונים שנוצרו ממערכות זעירות אלה להאכיל לתאומים דיגיטליים, אשר מדמיינת כורים בקנה מידה מלא וחיזוי ביצועים.

הנדסה גנטית לתרבות רציפה

(FLT:0) ביולוגיה ביולוגיה אסתטית (FLT:1) אפשרה לבניית זנים מיקרוביאליים המותאם במיוחד לתנאי תרבות מתמשכים.

  • [ה] יציבות גנטית:0 [ה] יציבות: 1 [FLT]: סטרינס עם נתיב גנים משולב ומקדם בלתי ניתן לחנך המתנגדים למוטציות ולאובדן של פריון לאורך זמן.
  • (FLT:0) ייצור סובלנות: אנדרט 1:1 הנדסת משאבות efflux או שינויים membrane כדי להגביר את ההתנגדות למוצרים רעילים כמו אלכוהול, חומצות אורגניות, או פותרים.
  • (FLT:0) ,הפיקה על ידי תוצר לוואי: FLT:1 , Knockout of Competways מתחרים כדי לכוון את הפלקס פחמן לעבר המוצר הרצוי, שיפור התשואות.
  • (FLT:0) תקנה: 1FLT:1 biosensors ו מעגלי משוב כי להתאים באופן דינמי ביטוי גנים המבוסס על רמות metabolite, חיקוי שליטה תעשייתית ברמה התאית.

לדוגמה, חוקרים ב-FLT:0) ג'וינט ביו-אנרגיה המכון 1 (Joint BioEnergy Institute) 1 (Hangigia Institute) נדסקו את ה-FLT:2E. coliveFLT 3) זנים אשר מייצרים ללא הרף את Isobutanol ב- titers גבוה בצ'רובאט במשך יותר מ-500 שעות ללא אובדן בולט של ביצועים.

יתרונות של מערכות תרבות רציפות

המעבר מ אצווה לפעולה רציפה מציע יתרונות כלכליים ותפעוליים משכנעים, במיוחד לייצור בקנה מידה גדול של כימיקלים וביו-פארמצבטיים.

מוצר איכותי יותר

מערכות רציפות פועלות 24 שעות ביממה, 7 ימים בשבוע, עם מינימום זמן השבתה.ריכוז תאים יציב הוא לעתים קרובות גבוה יותר מאשר צפיפות התא הממוצעת בריצה אצווה, והמוצר הוא תמיד קציר. עבור נפח כור מסוים, ייצור רציף יכול להשיג 2-5 פעמים יעילות נפח גבוהה יותר בהשוואה אצווה, בהתאם למוצר ולאורגניזם.

איכות המוצר עקבית

בתסיסה, תנאים סביבתיים (pH, רמת תת-קרקעית, ריכוז פסולת) משתנים עם הזמן, המוביל לזמינות אצווה-to-batch תרבות רציפה שומרת על תנאים קבועים פעם מצב יציב מושג, וכתוצאה מכך איכות מוצר אחידה.זה קריטי עבור מוצרי תרופות שבו יש צורך לנגיש מפרטים קפדניים.

עלויות יעילות

ירידה בירידה פירושה ניצול נכסים גבוה יותר.חיסול השלבים של ניקוי, סטריליזציה, בידוד, וקציר בין אצווה מורידים את עלויות העבודה והאנרגיה.תהליכים רציף גם להשתמש פחות מים לייצר פחות פסולת ליחידת המוצר. A 2022 מחקר שנערך על ידי FLT:0BiorolsFLT:1 העריכו כי המעבר למיזוג מתמשך יכול להפחית את עלויות התפעול על ידי 30–50% לייצור e-the.

Easier Scale-Up

מערכות תרבות רציפות הן לעתים קרובות קלות יותר לסקאלה של מערכות אצווה מכיוון שהן פועלות במצב יציב.אותן אלגוריתמים ותצורת חיישן ניתן ליישם על פני מעבדה, טייס, וקשקשים הייצור ברגע שהפרמטרים הקינטיים נקבעים.

גמישות למוצרים מרובים

על ידי התאמת שיעור הדילול והזנה של הרכב, ניתן להעביר מערכת תרבות רציפה כדי לייצר מוצר שונה מאותו כאסאסאסי מיקרוביאלי, או כדי לייעל מצב צמיחה שונה. גמישות זו היא ערך עבור מתקנים רב תכליתיים ולהתאמה לדרישות השוק.

אתגרים בהטמעת התעשייה

למרות היתרונות, אימוץ תעשייתי של מערכות תרבות רצופות נשאר מוגבל למגזרים מסוימים.הבנת האתגרים היא חיונית ליישום מוצלח.

סיכון ריכוז

מערכות רציפות פועלות במשך שבועות או חודשים, יצירת הזדמנויות ממושכות לזיהום.אירוע זיהום יחיד יכול להרוס את כל הריצה.חיבורי סטרילי, חותמות אמינות וטכניקה ספקנית קפדנית הם חובה.התקדמות ב-FLT:0single-use bioreactorsFLT:1 (החומרה מפלסטיק עם נמלים טרום-סטריליים) מופחתת הסיכון אך ורק עם אתגרים bioreasachirdable.

יכולת גנטית ופנוטי

מיקרואורגניזמים יכולים לעבור הסתגלות אבולוציונית תחת תרבות מתמשכת.מוטציות המפחיתות את הנטל המטבולי או להגדיל את קצב הצמיחה על חשבון היווצרות המוצר יכול ליישר את הזן הייצור.אסטרטגיות כדי להפחית את זה כולל באמצעות זנים auxotrophic, בלתי מובנים לטוקסין-אנטיטוקסין מערכות, ו ניטור קבוע של אוכלוסיות גנטיות באמצעות ריצוף של כל המין האנושי.

תהליך יציבות ואוסוציאציות

בשיעורי דילול מסוימים או תחת תנודות תזונתיות, תרבויות רציפות יכולות להציג תנודות ביומסה וריכוז המוצר.זה לעתים קרובות בשל סינכרוני בחלוקה התאית או לולאות משוב מטבוליות. אלגוריתמי בקרה מתקדמים (למשל, MPC לא ליניארי) יכול לחסן את התנוכים האלה, אבל הם מוסיפים מורכבות.

המונחים: Scale-Up Complexities

בעוד מערכות רציפות קלות יותר לסקאות בתיאוריה, נושאים מעשיים מתעוררים.לשלב זמן, העברת חמצן, הסרת חום הופכת להיות מאתגרת יותר בקנה מידה גדול. כור ניתוק מתמשך עשוי לדרוש מספר רב של מפגעים ו baffles כדי לשמור על הומוגניות. כללי Scale-up עבור מערכות רציפה שונים מ-שילוב זמן, למשל, חייב להיות קצר יחסית לזמן המגורים, אשר יכול להיות קשה בשיעורי משקל.

ה Hurdles כלכלי לייצור קטן

מערכות תרבות רציפות דורשות השקעה משמעותית בחיישנים, משאבות, אוטומציה ומנגנונים לא בטוחים. עבור נפח ייצור קטן או ערך גבוה, מוצרים בעלי ערך נמוך (למשל, חלבונים מסוימים recombinant), העלות הון עשויה לא להיות מוצדקת.

מחקרים ויישומים תעשייתיים

ייצור דלק Ethanol

התסיסה מתמשכת שימשה במשך עשרות שנים בתעשיית הדלק של ארצות הברית (הצמחים הגדולים ביותר בארצות הברית מפעילים מערכות מתמשכים באמצעות FLT:0Saccharomyces cerevisiaeofLT:1 או FLT:2Zymomonas mobilisFLT 3:0Saccharomyces , 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000 על ידי ⁇ , 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000 על ידי דילול, 000, 000 על ידי ⁇ , 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000, 000 על ידי דילול, 000.

ייצור קדחתני

חומצה קדחתית, כימיקל פלטפורמה עבור bioplastics, מיוצרת באופן תעשייתי באמצעות תרבות מתמשכת של חיידקים חומצה קדחתנית. A מופעלת ברציפות bioreactor עם מחזור תאים יכול להשיג ריכוזי חומצה גלקטית מעל 100 גרם / L עם המרה כמעט מלאה של גלוקוז.התהליך מפחית את הצורך לנטרל סוכנים ו downstream טיהור צעדים.

ייצור אנטיביוטיקה

ייצור פניצילין, המבוצע באופן מסורתי באכילת דואט, ראה ניסויים תרבותיים רצופים מוצלחים. a chemostat עם unmobilized FLT:0Penicillium chrysogenumFLT:1 יכול לשמור על הפרודוקטיביות במשך יותר מ 1000 שעות.המדינה היציבה מפחיתה את תדירות התוספות היקרות וסימולציות במורד הזרם.

חלבון רב-משמעי ו- Enzyme הפקה

תרבות רציפה משמשת יותר ויותר לייצור אנזימים תעשייתיים (למשל, הסתברות, תאים) באמצעות שימוש ב-FLT:0Bacillus subtilissFLT:1 או FLT:2;2Asgiperus nigerph nigerFLT 3: The רציף לפצות על הפרודוקטיביות הספציפית יחסית נמוכה של אורגניזמים אלה על ידי מתן חלון ארוך יותר עבור חלבונים מורכבים, אך הוא פשוט יותר עבור תאים מיקרו-מאליים, הוא יעיל יותר, אך הוא יעיל יותר, כמו גם עבור תרבות מיקרו-מאטורית היא יעילה יותר.

כיוונים עתידיים ומגמות מתפתחות

אינטליגנציה מלאכותית ותיאומים דיגיטליים

אלגוריתמי למידת מכונה מוחלים על אופטימיזציה של פרמטרים תרבותיים רצופים.רשת עצבית יכולה לעצב את היחסים בין שיעור דילול, הזנה הרכב וקצב המוצר, ולאחר מכן להציע נקודות כי למקסם את הפונקציה המטרה (למשל, פריון או תשואה) תאומים דיגיטליים - העתקים וירטואליים של הכור הפיזי - מאפשרים למפעילים לבחון שינויים ב-Silico לפני יישום אותם במפעל.

עצמאי ועצמי-Adapting Microbial Strains

הביולוגיה הסינתטית נעה לקראת פיתוח:0 (החומרים) עצמיים (FLT) 1 (המכונים מעגליים גנטיים) כדי לחוש את הסביבה שלהם ולהתאים את הביטוי בהתאם.לדוגמה, זן המונדס עם מקדם אחריות של מוצר יכול להעלות את הסינתזה הביולוגית כאשר ריכוז המוצר טיפות ומדמדנוח כאשר הוא עולה, פועל כבקר ביולוגי מקטין את הנטל על אוטומציה חיצונית.

שילוב עם אנרגיה מתחדשת

מערכות תרבות רציפות יכולות להיות מותאמות עם מקורות אנרגיה מתחדשים לסירוגין (סולר, רוח) כדי להפחית עלויות תפעוליות. במהלך תקופות של עודף חשמל, אלקטרוליטיזה יכולה לייצר מימן לתסיסה מיקרוביאלית; במהלך תקופות חשמל נמוכות, התרבות ממשיכה על מקורות פחמן מאוחסנים. גישה זו נחקרת עבור תהליכים כוח-לכימיים.

Modular bioprocessing

קומפקטי, bioreactors מתמשך מפותחים לייצור מבוזר.אלה יכולים להיות פרוסים באתרי חקלאות להמיר ביומסה לכימיקלים או להאכיל, צמצום עלויות התחבורה.יחידות ניידות שניתן להשתמש בהם גם הם תחת ניסיון תגובה חירום (למשל, ייצור חיטוי או חיסונים באתר במהלך התפרצויות).

מסקנה

מערכות תרבות רציפות מייצגות את הגבול הבא בייצור ביוכימי תעשייתי.על ידי שמירה על מיקרואורגניזמים בשלב צמיחה יציב של המדינה, הם להשיג יעילות גבוהה יותר, איכות עקבית, עלויות נמוכות יותר בהשוואה לתהליכים אנזופים מסורתיים. [+] התפתחויות טכנולוגיות עדכניות - מאוטומציה ומיקרו-מיקרו-קלימיקים ועד הנדסה גנטית ו-AI - טיפלו ברבים מהחסמים ההיסטוריים לאימוץ, מה שהופך את הביו-תרגול מתמשך יותר חזק ומדורגוחזק יותר.

בעוד אתגרים נשארים, במיוחד לגבי זיהום ויציבות גנטית, מחקרים שוטפים מבטיחים לספק מערכות יותר ויותר גמישות.שילוב של אנרגיה מתחדשת, תאומים דיגיטליים, וזנים של פיגור עצמי ישפרו עוד יותר קיימות וגמישות.עבור תעשיות החל מדלקים ביולוגיים לתרופות, המעבר לתרבות רציפה הוא לא שאלה של אם, אבל כאשר חברות שמשקיעות בטכנולוגיות אלה היום יהיו מכוונות היטב להובלת החדשנות הביולוגית הבאה.