מקדם את כתבי הגנטיקה של מדעי התרבות התא

כתבים מקודדים גנטית הפכו את האופן שבו מדענים צופים בתאים חיים, הופכים תמונות סטטיות לסרטים רצופים, בזמן אמתיים של התנהגות מולקולרית.במשך העשור האחרון, התחום התקדם במהירות, מניב מסר בהיר יותר, יציב יותר, ופרטים נוספים המאפשרים לחוקרים לשאול - ולענות - שאלות שהיו בעבר מחוץ להישגים עתידיים.

מה הם בעצם עיתונאים מהונדסים גנטית?

כתבים מקודדים גנטית הם מולקולות חלבון המייצרות אות מדידה – באופן קדחתני פלואורנסנס, ביומננטי, או שינוי צבעי – כאשר הם באים לידי ביטוי בתאי חיים.הגן מוצג לתוך הגנום התא (או נשמר כאפיך יציב) ולעיתים קרובות מבולבלגן של עניין או ממוקם תחת שליטתו של מקדם ספציפי.זה מאפשר לעיתונאי לפעול כ Proxy לפעילות תאית של רכיב של רכיב.

הרעיון מתוארך לחשיפתו של חלבון פלורסנט ירוק (GFP) מן הג'לי דג FLT:0Aequorea victoriaphiaphFLT:1 בתחילת שנות ה-90, עבודה שהרוויחה אוסמומורה, מרטין צ'יפסי, ורוג'ר Y.Tsien פרס נובל לכימיה לשנת 2008.

(ב) ⁇ (ב) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
(ב) ויקרא י"א: ויקרא י"ד): "כמו ויקרא ויקרא ויקרא ויקרא יט" (ב"ב, כ"ד) ו"נ'ולוק" (ב"ב) אשר הוליד אור באמצעות תגובה של אנזים, ללא תאורה חיצונית.
(FLT:0)BiosensorsensesFLT:1 אשר משנה את השטף או הביומננטיות שלהם בתגובה למולקולות ספציפיות (למשל, סידן, ATP, pH) או שינויים לאחר-טרנסלציה (למשל, זרחן).
(FLT:0) כתבים ספירליים FLT:1 אשר מתאספים חלבונים פונקציונליים רק כאשר שני שותפים אינטראקציה באים קרוב (שימוש במחקרים של אינטראקציה בין חלבונים לחלבון).

בתרבות התאית, כלים אלה מאפשרים לחוקרים לדמיין תהליכים דינמיים עם רזולוציה גבוהה של זמניות. כי הכתבים הם מקודדים גנטית, הם יכולים להיות מודגשים בקווי תאים או מוצגות באופן קבוע, מתן חלון לא פולשני לתוך תא החי.

התקדמות טכנולוגית חדשה

התקדמות בהנדסה חלבון, אבולוציה מכוונת, וביולוגיה סינתטית שיפרו באופן דרמטי את הביצועים של כתבים מקודדים גנטית. אזורי מפתח של התקדמות כוללים חלבונים בהירים יותר ויותר phototable fluorescent, כיתות חדשות של ביוסנסורים עם קינטיקה מהירה יותר, ואת הרחבת של הצבעים ספקטרליים עבור הדמיה מרובותxed.

חלבונים משופרים

תחום החלבונים פלואורסנט עבר הרבה מעבר ל-GFP המקורי. וריאנטים מודרניים מציעים תכונות מותאמות ליישומים ספציפיים.

(FLT:0) פליטת הפליטה והתשואות הקוונטיות הגבוהות יותר: OVAFLT:1 חלבונים כגון mN Greeneon (91% תשואה קוונטית) ו mScarlet (70% תשואה קוונטית) מספקים אותות חזקים משמעותית מקודמיהם, המאפשרים זיהוי של מטרות בעלות נמוכה וזמני התבוננות ארוכים יותר.
(FLT:0) ,Enhanced phototability:FreaLT:1 אבולוציה ישירה יצרה גרסאות שמתנגדות לצילום אפילו תחת תאורה אינטנסיבית, קריטי עבור הדמיה של זמן וטכניקות על-ידי רזולוציה.
(FLT:0) Expanded Color: FLT:1 מכחול (mTagBFP2) עד רחוק-אדום (miRFP670, mCardinal), החוקרים עכשיו יש גישה למגוון רחב של ספקטרלי. Far-red-red וסמוך-infrared פלואורסנט חלבונים (למשל, סדרת iRFP מ חיידקיטרופיורו) הם בעיקר בגלל הרעלת חשמלאיות ולהפחית ממין ולהפחית את רמת הסוכרת של מחלות דם נמוכה ולהפחית את רמת הסוכרת.
(FLT:0) צורות מונומריות ודימריות: אנדרל 1 (איור 1:0) מכונים גרסאות מונומריות מונומריות (למשל, mEGFP, mCherry) מונעות הדבקה חפצים והכרחיות עבור חלבונים היתוך.

שיפורים אלה איפשרו לצלם מבנים סלולריים מרובים בו זמנית, לעקוב אחר מולקולות בודדות בתאים חיים ולבצע ניתוחים כמותיים עם ביטחון.

גנטיקה: Encoded Biosensors

ביוסנסורים מייצגים את אחד האזורים המרגשים ביותר של קידום.בניגוד לתגיות פלואורסנט פשוטות, ביוסנסורים משנים את התכונות האופטיות שלהם בתגובה לאירוע ביולוגי, ומספקים קריאות פונקציונליות.

(FLT:0 ⁇ Calcium:FLT:1 The GCaMP (GCaMP6, JGCaMP8) ו- RCaMP המואר האדום שלו משמשים נרחב לפקח על פעילות עצבית, התכווצות תאי לב, ותהליכים אחרים תלויות סידן.הגרסאות האחרונות (GCaMP8s, JGCaMP8f) יש שיפור ואיות אותות של תאים, המאפשרים, יחס זיהוי פוטנציאלי של פעילות יחידה.
(FLT:0) חיישנים של Metabolite:FLT:1ure Fluorescent אינדיקטורים גלוקוז (FLII12Pglu-700 ⁇ 6), ATP (QueenEN, PercevalHR), ו NADH /NAD+ (Peredox) מאפשרים מעקב בזמן אמת של מצבים מטבוליים.חיישנים אלה מבוססים לעתים קרובות על חלבונים עמידים חיידקיים או דומיינים של חלבונים מטבוליים.
(FLT:0) כתבי מסלול של ה-A-kining:FLT:1[עריכת קוד מקור | עריכה] ועיתונאי הפעילות המבוסס על A-kinase (AKAR) מאפשר מדידה דינמית של פעילות קינזיה. אחרים, כמו T-REX (עיתונאית טירונית של מערכת ERK), ללכוד את מסלול ההפעלה באמצעות היערכות גרעינית מקומית.
(FLT:0 ⁇ Voltage:FLT:1Build גנטיקה מוצפנת אינדיקטורים (GEVIs) כגון ASAP3 ו- Archon1 מספקים קריאות בקנה מידה של מילימטר של פוטנציאל מנברן בתאים קשים, משלימים טכניקות ⁇ מסורתיות.
(FLT:0)pH וחיישנים של Redox: FLT:1 חיישנים כמו pHluorin (pH) ו- HyPer (H2O2) מאפשרים זיהוי מדויק של סביבות סלולריות.

המגמה בפיתוח biosensor היא לעבר קינטיקה מהירה יותר, טווח דינמי גבוה יותר, ו תאימות רב צבע, המאפשר ניטור בו זמנית של כמה מטרות באותו תא.

כתבי עת ו- BRET

כתבים ביומנום, שאינם דורשים ציטוט חיצוני, מציעים אלטרנטיבה אטרקטיבית ל פלואורסנס ללימודים ארוכי טווח שבו phototoxicity או autofluorescence רקע הוא דאגה. luciferase מן ה- ea ⁇ FLT:0Oplophorus gracirosspvsur) בשילוב עם חיישנים היברידיים (CacirossplirossFLT:1), ננו, הוא בהיר וקטן במיוחד (19 k כאשר הוא מתאים עם חלבונים סגסוגת NPTi) עם ® (Nbn) עם סגסוגת עם ®2cfery) יכול לשלב סגסוגת עם סגסוגת נוזל חום (NVirdine) מטבולית (Nbnbn) כדי לספק) עם סגסוגת) מטבוליתרון) עם ⁇ dine) מטבוליתרון (Nbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbnbn) כדי ליצור ⁇ d) כדי

יישומים בלימודי תרבות תאים

כתבים מקודדים גנטית הפכו לכלים בכל מקום במחקר של תרבות התא, המאפשרים תובנות לביולוגיה בסיסית וגילוי תרופות מאיץ.

מעקב בזמן אמת של ג'ין אקספרסion

על ידי הצבת גן עיתונאי תחת שליטתו של מקדם עניין, מדענים יכולים למדוד פעילות מיתאמת בתאי חיים לאורך זמן.לדוגמה, השימוש בחלבונים פלואורסנטיים מופרכים (למשל, d2EGFP) עם חצאי חיים קצרים מאפשר לעיתונאי לעלות ולתרד במהירות בתגובה לשינויים גירויים, מתן קריאה נאמנה של פעילות מתקדמת.

גילוי דעת גבוה וגילוי סמים

מיקרוסקופים אוטומטיים בשילוב עם קווי תאים ביטויים של כתב המאפשרים הקרנה תוכן גבוה (HCS) של ספריות קטנות-מולקוליות (לדוגמה, קו תא המבטא עיתונאי מעבר גרעיני (למשל, NF ⁇ B-GFP) ניתן להשתמש כדי להציג את כתבי ה- HIV (n) באופן משמעותי, חיישנים שקריים (Fexi) או חיזוי מחזורי דם חיובי (Fexi) כגון: CEX) של תאים פגומים (Fexi) או מחזורי דם חיובי (Fexi) באופן דומה, למשל, למשל, למשל, לדוגמה, לדוגמה, לדוגמה, CPT) של תאים מזיקים (Fexi) של תאים מזיקים (FexiFexi) או , למשל, למשל, למשל, למשל, לדוגמה, למשל, לדוגמה, לדוגמה, למשל, חיישנים אלה (FexiFexi) של תאים מזיקים (Fexi) של תאים מזיקים (מסוגים).

אינטראקציות חלבון-Protein ו Localization Dynamics

חלבונים מפוצלים (למשל, פיצולGFP, פיצולmCherry) והשלמת ביומנום (NanoBit) מאפשרים לחוקרים לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים.כתבים אלה אינם מתאימים למיפוי רשתות אותות ואימות מטרות סמים פוטנציאליות.בנוסף, כתבים שמשנים את ההקצנה על הפעלה (למשל, membrane-transne-translocating) המאפשרים מחקרים של חלבון קינטיים.

ניתוח Flux

ביושמים מטבוליים פתחו חלונות חדשים לתוך אנרגטים סלולריים.לדוגמה, PercevalHR ( חיישן של יחס ATP:ADP) ואת חיישן NADH Peredox שימש כדי ללמוד כיצד תאים סרטניים rewire חילוף החומרים שלהם (אפקט Warburg) וכיצד mitochondria להגיב לרעלים.

ביולוגיה התפתחותית וסרטן

קווי תאים עיתונאיים הם כלים חיוניים ללימוד שונות.לדוגמה, תאי גזע עובריים אנושיים המבטאים עיתונאי GFP תחת מקדם OCT4 ניתן להשתמש כדי לפקח על מעמד כתבים בלתי אפשריים המונעים על ידי מקדם ספציפי קואג (למשל, SOX17 עבור אנדודור) לאפשר מעקב בזמן אמת של מסלולים שונים.

אתגרים והגבלות נוכחיות

למרות כוחם, לכתבים מקודדים גנטית יש מגבלות שחוקרים חייבים לשקול.

(FLT:0) פוטו-טוקסין וצילומים: ההרחבה 1 (FLT:1) גם עם חלבונים משופרים פלואורסנט, הדמיה ממושכת עלולה לפגוע תאים.שימוש ב-FPs בהיר יותר מפחית את עוצמת התאורה הנדרשת, אך phototoxicity נותרה דאגה למחקרי חלוף זמן ארוכים.
(FLT:0) השפעות פולשניות של תגי היתוך: קיד 1 (איור 1) ניצול עיתונאי לחלבון של עניין יכול לשנות את תפקודו, הייחוד או יציבות.
(FLT:0) זמן רוויה: 1FLT חלבונים פלואורסנט דורשים זמן לקפל וליצור כרוב (בכפוף למקרים מהירים), כתבים עם הזדווגות מהירה יותר (למשל, מון ירוק) מועדפים, אך יש עדיין כמה כתבים שעדיין יש עיכובים שעשויים להחמיץ דינמיקות מהירות.
רמות ביטוי ו רעילות: FLT:1 Overexpression של כתבים יכול להוביל להיווצרות מצטברת או נטל מטבולי. קווי תאים עם שילוב קוד נמוך או מקדם בלתי ניתן לחנך לעזור להפחית את הבעיות האלה.
(FLT:0) Background autofluorescence:FLT:1 תרבות מדיה ורכיבים סלולריים (למשל, פלבינס) יכול לייצר autofluorescence אשר מפריע חלבונים ירוק / אדום פלואורסנט.

הבנת המגבלות הללו היא המפתח לתכנון ניסיוני.לדיון מקיף על שיטות העבודה הטובות ביותר, מתייחס למדריך של ההרחבה:0Addgene ל- Fluorescent חלבונים SelectionFLT:1.

בחירת קריטריה לבחירת עיתונאי

עם כל כך הרבה כתבים זמינים, בחירת הימין ניתן להסס.שיקולים מרכזיים כוללים:

(FLT:0) אקספרסיונרטור ואורך גל פליטה: FIRLT:1) בחר עיתונאי שמתאים לסננים של המיקרוסקופ שלך ומצמצם את החפיפה הספקטרוםית עם כתבים אחרים.
(ב) ⁇ :0) זכות ודמיון: [13] עבור הדמיה כמותית, בחר כתבים עם תשואה קוונטית גבוהה ושיעורי צילום נמוכים.
(ב) ⁇ :0) ⁇ (ה) לתהליכים מהירים (למשל, סידן טראנסים), השתמשו בכתבים עם קצב מהיר על-ידי-המסומים.
(ב) ⁇ :0) טווח דינמי: 1FLT:1 עבור ביוסנסורים, טווח דינמי גדול יותר משפר את הרגישות.
(ב) ⁇ :0) ,ההתמדה וההשפלה: וודאו שהעיתונאי בוגר במהירות מספיק עבור היישום שלכם, ואם יש צורך בכך, יש לו מחצית חיים קצרה כדי לעקוב אחר אותות הפחתת אותות.
(בהקשר קונסולרי:0) ,1 כתבים עובדים טוב יותר בסוגים מסוימים של תאים (למשל, FPs ליד- infrared דורשות biliverdin, אשר ייתכן שיהיה צורך להשלים בתרבות).

מקור:0.1.10.1: FPbaserovalFLT 1 מספק מאגר נתונים לחיפוש אחר של תכונות חלבון פלואורסנט שיכולות לסייע בקבלת החלטות.

כיוונים עתידיים

הדור הבא של כתבים מבטיח אפילו יכולות גדולות יותר.כמה מגמות מתעוררות מעצבות את השדה:

קרוב ל-Infrared and Optogenetic Reporters

קרוב ל-infrared fluorescent חלבונים (למשל, סדרת miRFP, iRFP) מאפשרים הדמיה עמוקה באמצעות רקמות ולהפחית את הנזק התאי. כתבים אופטיים המשלבים תחומים של חשיפה לאור עם דומיינים מפותחים גם, המאפשר ביטוי גנים מבוקר אור או חלבון מקומי בתוך אותו הניסוי.

חיישנים מרובים

ההתקדמות באלגוריתמים לא מעורבים ולוחצים מאפשרת להשתמש בחמישה או יותר כתבים בו זמנית.לדוגמה, תא יחיד יכול לספק חיישנים עבור סידן, pH, מתח, ופעילות kinase, מתן תצוגה רב-פרמטרית של מצב התא.

אינטגרציה למידת מכונות

מודלים של למידת מכונות המוכשרים על נתונים דימות גדולים יכולים לחלץ מידע מסימנים עיתונאיים שיהיו בלתי נראים לעין האנושית.לדוגמה, למידה עמוקה יכולה לחזות מסילות תאים בודדים מדינמיקה מוקדמת של הכתב, או לסווג מדינות תאים המבוססות על וריאציות עדינות בדפוסי ביטוי עיתונאי.

ב-Viovo ו- 3D Culture Compatibility

עיתונאים מונדסים כדי לתפקד בסביבות מאתגרות יותר, כגון אובסטרואידים ו- 3D spheroids, שבו ⁇ חמצן ופיזור אור מציבים בעיות נוספות. Brighter, המוחלפות, וכתבי לוח תמונות הם חיוניים עבור יישומים אלה.

מערכות משופרות לוציפראז-לגן

זוגות חדשים של luciferase עם פליטה בהירה יותר חדירה רקמות טובה יותר נמצאים בפיתוח. כתבים אוטונומיים (התפזרות FP) המשלבים את היתרונות של פלואורנסשן ו ביוומונים הם אזור מבטיח של מחקר.

מסקנה

כתבים מקודדים גנטית הפכו הכרחיים בלימודי תרבות תאים, מספקים חלון לא פולשני, בזמן אמת לתוך המכונות המולקולריות של תאים.התפתחויות אחרונות בהנדסה חלבון סיפקו כלים בהירים יותר, יציבים יותר, ועוד תכליתיים יותר, המאפשר לחוקרים לפקח על פלוקסים, מצבים מטבוליים, אותות מסלולים מטבוליים, וביטוי גנים עם דיוק חסר תקדים.

(ב) לחוקרים חדשים בתחום, החל מהכתבים המוערכים ממאגרים אמינים (כגון FLT:0AddgenecioFLT:1) והתייעצות עם ביקורות מקיפים, כגון זה שפורסם ב-FLT:2reaFLT 3:2sFLT 3:0 (Randguez et al., 2017) LT5, יכול להאיץ את הניסויים המוצלחים של ה-FLTD.