आधुनिक आनुवंशिक अनुसंधान ने एक परिवर्तनकारी युग में प्रवेश किया है जो सटीक जीन संपादन उपकरण के विकास से प्रेरित है। अग्रणी प्रौद्योगिकियों में, TALENs (ट्रांसक्रिप्शन एक्टाइवेटर-लीक इफैक्टर न्यूक्लेज़) और ZFNs (जिंक फिंगर न्यूक्लेज़) फाउंडेशनल प्लेटफॉर्म के रूप में खड़े हो जाओ जो CRISPR क्रांति से पहले लक्षित डीएनए संशोधन को सक्षम बनाता है। ये इंजीनियर प्रोटीन वैज्ञानिकों को परिभाषित जीनोमिक स्थानों पर डबल-स्ट्रैंड ब्रेक लगाने की अनुमति देते हैं, जिससे सेल के अनंत मरम्मत पथ-गैर-मानवीय अंत में शामिल होने (NHEJ) या समोगिक-निर्देशित मरम्मत (HDR) को छोड़कर, मूल कृषि सुधार को प्राप्त करने या उनके जैविक सुधार में सक्षम बनाने की आवश्यकता होती है।

TALENs और ZFNs के तंत्र को समझना

जिंक फिंगर न्यूक्लेज़: मॉड्यूलर डीएनए मान्यता

ZFNs पहला व्यापक रूप से अपनाया प्रोग्राम करने योग्य नाभिक थे, जिसे पहले 1990 के दशक के मध्य में वर्णित किया गया था। प्रत्येक ZFN में एक डीएनए-बाइंडिंग डोमेन शामिल है जो जस्ता उंगली प्रोटीन से इकट्ठा होता है और एक डीएनए-क्लाइवेज डोमेन FokI प्रतिबंध endonuclease. व्यक्तिगत जस्ता उंगली मॉड्यूल आम तौर पर एक तीन-नाभिकीय क्षेत्र को एक साथ पहचानते हैं। टैंडेम में कई उंगलियों को जोड़ने से, शोधकर्ता 9 से 18 बेस जोड़ों तक के अनुक्रम को लक्षित कर सकते हैं। FokI[FLT: 3]] को डीएनए को काटने के विपरीत क्षेत्र में विभाजित करने के लिए एक दो Ztar-Ftrue को विभाजित करना चाहिए।

जस्ता उंगली सरणी के डिजाइन और असेंबली को तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि संदर्भ-निर्भर आत्मीयता - एक जस्ता उंगली की पहचान आसन्न उंगलियों से प्रभावित हो सकती है। फिर भी, OPEN (Oligomerized पूल इंजीनियरिंग) और संदर्भ-निर्भर असेंबली जैसे तरीकों में भविष्यवाणी की गई है। ZFNs का उपयोग नॉकआउट सेल लाइन बनाने के लिए किया गया है, जो प्रारंभिक नैदानिक परीक्षणों में ट्रांसजेनिक पशु मॉडल उत्पन्न करता है और सही रोग-काउजिंग उत्परिवर्तन उत्पन्न करता है।

ट्रांसक्रिप्शन एक्टाइवेटर-लीक इफ़ेक्टर न्यूक्लेज़: सिंगल-न्यूक्लियोटाइड स्पेसिफिकेशन

TALENs 2009-2010 के आसपास सरल डिजाइन नियमों के साथ एक विकल्प के रूप में उभरा। उनके डीएनए-बाइंडिंग डोमेन ट्रांसक्रिप्शन सक्रियक जैसे प्रभावकारों (TLE) से आता है, प्रोटीन संयंत्र रोगजनक (]Xanthomonas द्वारा स्रावित। प्रत्येक TALE मॉड्यूल वास्तव में एक nucleotide को पहचानता है, जो दो अतिरंजित अमीनो एसिड अवशेषों द्वारा निर्धारित होता है - जिसे दोहराने वाले परिवर्तनीय diresidue (RVD) के रूप में जाना जाता है। सबसे आम RVD-nucleotide युग्मिंग्स, Adenine के लिए एनआई हैं, इन डीएनए के लिए HD, लगभग किसी भी क्रम मॉड्यूल (NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

TALENs भी ]FokI क्लीवेज डोमेन का उपयोग करते हैं और इसे काटने के लिए युग्मित बाइंडिंग की आवश्यकता होती है। TALE दोहरा सारणी की असेंबली को गोल्डन गेट क्लोनिंग या ठोस चरण संश्लेषण का उपयोग करके हासिल किया जा सकता है। TALENs आम तौर पर ZFNs की तुलना में उच्च विशिष्टता और कोशिकाओं में कम विषाक्तता प्रदर्शित करते हैं, हालांकि उनका बड़ा आकार (~ 3 kb प्रति मोनोमर) वायरल वितरण के लिए एक सीमा हो सकता है। फिर भी, उन्हें सफलतापूर्वक ज़ेबराफ़िश, चूहा, सुअर और मानव कोशिका लाइनों में लागू किया गया है, और कई प्रीक्लिनिकल जीन थेरेपी अध्ययनों में।

ऐतिहासिक विकास और माइलस्टोन

इंजीनियर न्यूक्लस की यात्रा 1980 के दशक के अंत में जस्ता उंगली प्रोटीन की खोज के साथ शुरू हुई। 1996 में, चंद्रशेगरन और सहयोगियों ने तीन-जिंक-फिंजर डोमेन को FokI] में फ्यूज किया, पहला ZFN बना। इस सफलता ने लक्षित जीनोम संपादन को ]Drosophila]] में और बाद में मानव कोशिकाओं में विभाजित किया। 2005 तक, ZFNs का उपयोग ]CCR5]]Guf[FLT]]A नैदानिक प्रतिरोध के लिए किया गया।

TALEN प्रौद्योगिकी 2007 में TALE प्रोटीन के संरचनात्मक उन्मूलन के बाद तेजी से विकसित हुई। तीन वर्षों के भीतर, कई समूहों ने खमीर, पौधों और मानव कोशिकाओं में जीन संपादन के लिए कार्यात्मक TALENs की सूचना दी। उनकी सादगी ने अकादमिक प्रयोगशालाओं के लिए बाधा को कम कर दिया ताकि जीनोम संपादन को अपनाया जा सके, खोज की लहर को स्पार्क किया। 2012 तक, TALENs का उपयोग रोग मॉडलिंग और ज़ेनोट्रांसप्लांटेशन अनुसंधान के लिए पहली जीन-संशोधित सूअर बनाने के लिए किया गया था। ] किम और किम (2014) द्वारा ]Nature समीक्षा आनुवंशिकी [FLT: 32] दोनों समानांतर प्रौद्योगिकियों का विकास] [FLT: 32]

आधुनिक अनुसंधान में अनुप्रयोग

चिकित्सा अनुसंधान और जीन थेरेपी

ZFNs और TALENs ने मोनोजेनिक विकारों के लिए जीन थेरेपी को उन्नत किया है। बीमार सेल रोग और बीटा-थालसिमीयता में, ZFNs ने BCL11A ] erythroid बढ़ाने वाले भ्रूण के हेमोग्लोबिन अभिव्यक्ति को सक्रिय किया। ZFNs का उपयोग करके एक चरण 1/2 नैदानिक परीक्षण (NCT03282656) एक गंभीर जांचकर्ता (CTRX) में सुधार हुआ है।

कृषि जैव प्रौद्योगिकी

फसल सुधार में, TALENs और ZFNs का उपयोग जड़ी-बूटियों के लिए प्रतिरोधी किस्मों और रोग प्रतिरोधी किस्मों के निर्माण के लिए किया गया है। पहले विपणन TALEN ने फसल की सहायता की - बेहतर तेल प्रोफाइल के साथ एक सोयाबीन - Calyxt द्वारा विकसित किया गया था और 2019 में जारी किया गया था। ZFNs को अनाज के आकार के नकारात्मक नियामकों को नॉक करके चावल में उपज बढ़ाने के लिए लागू किया गया है। इन नाभिकीय विशेषताओं की उच्च विशिष्टताओं में अभेद्य जीनोमिक परिवर्तन को कम किया गया है, जो नियामक स्वीकृति के लिए फायदेमंद है। [FLT: 0] जोंग और सैंडर (2013) द्वारा विस्तृत विश्लेषण [FLT: 3Nature BioLT]

कार्यात्मक जीनोमिक्स और मॉडल ऑर्गनिज्म

दोनों प्लेटफार्मों ने प्रजातियों में व्यवस्थित जीन नॉकआउट अध्ययन को सक्षम किया है जहां भ्रूण स्टेम कोशिकाएं अनुपलब्ध थीं। ज़ेबराफ़िश में, TALENs का उपयोग एक एकल संघ प्रयास में> 200 लक्षित उत्परिवर्तक बनाने के लिए किया गया था, जो विकास और रोग में जीन कार्यों का खुलासा करता था। चूहों में, ZFNs ने p53] के कैंसर मॉडल बनाने के लिए ट्यूमर दबाने वाले को बाधित किया। एकल-संक्रमित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड दाताओं का उपयोग करके एचडीआर के माध्यम से सटीक बिंदु उत्परिवर्तन उत्पन्न करने की क्षमता ने न्यूरोडीजेनेरेटिव और कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों के लिए नॉक-इन मॉडल के प्रदर्शन के लिए प्रतिरूप का विस्तार किया है।

CRISPR-Cas9 की तुलना में ताकत और सीमा

CRISPR-Cas9 (2012) के उद्भव ने सरल डिजाइन, बहुसंकेतक क्षमता और उच्च दक्षता की पेशकश की, जिससे इसके व्यापक गोद लेने की संभावना बढ़ गई। हालांकि, TALENs और ZFNs अद्वितीय लाभ को बरकरार रखते हैं। उनके प्रोटीन आधारित डीएनए मान्यता आरएनए पर भरोसा नहीं करती है, जो आरएनए के जोखिम को समाप्त करती है - ध्यानपूर्वक बंद टारगेट प्रभाव। इसके अलावा, ZFNs और TALENs दोहराई गई कठिनाई या जीसी-संग्रह क्षेत्रों के साथ अनुक्रमों के लिए उच्च विशिष्टता प्रदर्शित करते हैं जो CRISPR लक्ष्य को चुनौती देते हैं। इन संरचनाओं का बड़ा आकार (~4-10 kb) एडनो-associated वायरस (दोहरे) में पैक किया जा सकता है लेकिन मिनी-शक्तियों के साथ।

एक प्रमुख सीमा लागत और श्रम है जो प्रत्येक लक्ष्य के लिए नए ZFNs या TALENs को इंजीनियर करने की आवश्यकता है। जबकि CRISPR को केवल 20-bp गाइड अनुक्रम के डिजाइन की आवश्यकता होती है, ZFN और TALEN संश्लेषण प्रोटीन डोमेन असेंबली और सत्यापन की मांग करता है। ऑफ-टैरगेट क्लीवेज भी एक चिंता है; जस्ता उंगली की सारणी धुंध को बर्दाश्त कर सकती है, और TALENs आंशिक लक्ष्य साइटों पर कटौती कर सकती है। गाइड-सेक या CIRCLE-Seq जैसे तरीकों का उपयोग करके व्यापक रूप से अपंगतिरिष्कृत प्रोफाइल में एक 2017 समीक्षा [[FLT: 3LT]

भविष्य की दिशा और चल सुधार

वर्तमान अनुसंधान का उद्देश्य उत्पादन लागत को कम करते हुए TALENs और ZFNs की दक्षता और सुरक्षा को बढ़ावा देना है। प्रोटीन इंजीनियरिंग में अग्रिमों ने बेहतर थर्मोस्टेबलिटी और कम साइटोटॉक्सिसिटी के साथ ZFNs को पैदा किया है। संरचना-निर्देशित एल्गोरिदम अब चुनौतीपूर्ण लक्ष्यों के लिए इष्टतम RVD संयोजनों की भविष्यवाणी करते हैं, और उच्च-थ्रूपुट गोल्डन गेट क्लोनिंग सरणी एक दिन में निर्माण को सक्षम बनाती है।

डिलिवरी विवो अनुप्रयोगों के लिए एक बोतलबंद रहता है। लिपिड नैनोपार्टिकल्स और एडेनो-एसोसिएटेड वायरल वेक्टर को हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल और हेपेटोसाइट्स के लिए परिष्कृत किया जा रहा है। ZFN / TALEN प्रोटीन (DNA) की क्षणिक डिलीवरी ने लंबे समय तक न्यूक्लियस अभिव्यक्ति और ऑफ-टैरगेट इवेंट्स को कम कर दिया है। कृषि में, TALENs का उपयोग Cisgenic फसलों को विकसित करने के लिए किया जा रहा है जो विदेशी डीएनए के बिना प्राकृतिक एले को घुसपैठ करती है। नियामक परिदृश्य इन प्री-क्रिसपीआर उपकरणों को उनके स्थापित सुरक्षा रिकॉर्ड और बाजार अनुमोदन के कारण पसंद कर सकता है।

अंत में, TALENs या ZFNs का संयोजन बेस एडिटिंग या प्राइम एडिटिंग के साथ-साथ, जो कि डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के बजाय निकोस पर निर्भर करता है- उनकी उपयोगिता को बढ़ा सकता है। उदाहरण के लिए, एक Zn-finger-linked cytidine deaminase डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के बिना लक्ष्य आधार रूपांतरण कर सकता है। ZFN-based ] पर प्रकाशित नैदानिक परीक्षण संपादन (Tebas et al., 2014, [FLT: 3]] न्यू इंग्लैंड जर्नल ऑफ मेडिसिन [FLT:] कि पारंपरिक निवेश के लिए जारी है।

निष्कर्ष में, TALENs और ZFNs आनुवंशिक अनुसंधान उपकरण बॉक्स में महत्वपूर्ण रहते हैं। उनके विशिष्ट गुण-मॉड्यूलर डीएनए मान्यता, उच्च विशिष्टता, और सुरक्षा की स्थापना की - उन्हें कुछ अनुप्रयोगों के लिए अपूरणीय बना दिया गया है, खासकर जब RNA आधारित उपकरण अनुपयुक्त हैं। चूंकि क्षेत्र सटीक चिकित्सा और टिकाऊ कृषि की ओर जाता है, इसलिए ये अग्रणी नाभिक मानव स्वास्थ्य और खाद्य सुरक्षा में सुधार करने वाली खोजों को उत्प्रेरित करते रहेंगे।