उच्च-थ्रूपुट कार्यात्मक स्क्रीनिंग में विकास

जीनोमिक्स में हाल के अग्रिमों ने लगभग इस बात की समझ को बढ़ाया है कि आनुवंशिक विविधता स्वास्थ्य, रोग और दवा प्रतिक्रिया कैसे चलती है। मानव जीनोम लाखों प्रकार के भिन्न होते हैं, फिर भी उनके कार्यात्मक परिणामों के संदर्भ में विशाल बहुमत का अनाकार होता है। व्यक्तिगत रूप से अध्ययन के लिए पारंपरिक तरीके - जैसे कि साइट-डायरेक्टेड mutagenesis के बाद कम-थ्रूपुट assays - आधुनिक जीनोमिक्स की मांगों को पूरा करने के लिए बहुत धीमी और महंगा है। उच्च-थ्रूपुट कार्यात्मक स्क्रीनिंग (HTFS) एक परिवर्तनकारी समाधान के रूप में उभरा है, जो एक ही नैदानिक अध्ययन में हजारों लोगों के साथ कार्यात्मक आकलन को सक्षम बनाता है।

उच्च-थ्रूपुट कार्यात्मक स्क्रीनिंग का परिचय

उच्च-थ्रूपुट कार्यात्मक स्क्रीनिंग प्रयोगात्मक तरीकों के एक सूट को संदर्भित करती है जो व्यवस्थित रूप से एक सहज जैविक readout पर कई आनुवंशिक बदलावों के प्रभाव का परीक्षण करती हैं। मुख्य सिद्धांत है कि वेरिएंट अनुक्रमों की बड़ी पुस्तकालयियां बनाना, उन्हें एक प्रासंगिक सेलुलर मॉडल में पेश करना, और फिर उन कोशिकाओं को क्रमबद्ध करना या मापना जो एक फेनोटाइप ऑफ ब्याज (जैसे, जीन अभिव्यक्ति, सेल फिटनेस, प्रोटीन गतिविधि) पर आधारित हैं। डीएनए संश्लेषण, अनुक्रमण और स्वचालन में अग्रिम ने सप्ताह के एक मामले में हजारों वेरिएंटों के दसियों युक्त डिजाइन, निर्माण और परीक्षण पुस्तकालयों को संभव बनाया है। ये विधियां विशेष रूप से उन क्षेत्रों के वर्गों के वर्गों को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

कोर टेक्नोलॉजीज ड्राइविंग हाई-थ्रूपुट स्क्रीनिंग

कई शक्तिशाली प्रौद्योगिकियों ने आधुनिक HTFS को अपनाया है, प्रत्येक अपनी खुद की ताकत और अनुप्रयोगों के साथ।

CRISPR-आधारित स्क्रीन

CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी ने एक स्केलेबल तरीके से सटीक जीनोम संपादन को सक्षम करके कार्यात्मक जीनोमिक्स को क्रांतिकारी बदलाव किया है। एक विशिष्ट पूल CRISPR स्क्रीन में, हजारों जीनोमिक साइटों को लक्षित करने वाले एकल गाइड RNAs (sgRNAs) की एक लाइब्रेरी को सेल में एक फेनोटाइप पर स्थिर रूप से व्यक्त करने के लिए वितरित किया जाता है। परिणामस्वरूप संपादन - इंसर्टियन, डिलेशन, या बिंदु उत्परिवर्तन - यह संभव स्क्रीन के रूप में सटीक विश्लेषण या संभावित रूप से ज्ञात प्रोटीन विश्लेषण के लिए प्रमुख रूप से विकसित किया गया है।

मास्सिकल समांतर रिपोर्टर परख (MPRAs)

MPRAs जीन अभिव्यक्ति पर हजारों नियामक वैरिएंट के प्रभाव को संभालने के लिए पसंद की विधि है। एक ठेठ MPRA में, डीएनए अनुक्रमों की एक लाइब्रेरी (प्रत्येक रुचि के एक संस्करण युक्त) एक न्यूनतम प्रमोटर और एक रिपोर्टर जीन (जैसे, GFP, luciferase, या बारकोड) का क्लोन अपस्ट्रीम है। पुस्तकालय को कोशिकाओं में पेश किया जाता है, और रिपोर्टर RNA या प्रोटीन की बहुतायत अनुक्रमण द्वारा निर्धारित की जाती है। इनपुट लाइब्रेरी में आउटपुट की तुलना करके, शोधकर्ता यह समझ सकते हैं कि प्रत्येक संस्करण ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को कैसे बदल देता है। MPRAs का उपयोग व्यवस्थित रूप से GWAS जोखिम वेरिएंटों का मूल्यांकन करने और कार्यात्मक पहचान करने के लिए किया गया है।

अन्य उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण

संतृप्ति mutagenesis गहरी अनुक्रमण (जैसे, गहरी mutational स्कैनिंग) के साथ मिलकर एक प्रोटीन डोमेन में हर संभव एकल अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। सिंथेटिक जीवविज्ञान उपकरण, जैसे नियामक दृश्यों की combinatorial पुस्तकालयों, splicing, अनुवाद, और प्रोटीन स्थिरता के अनुक्रम निर्धारकों को उजागर करने में मदद करते हैं। इसके अतिरिक्त, उच्च-थ्रूपुट प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग (FACS) जैसी तकनीकें रिपोर्टर संरचनाओं पर आधारित वांछित संस्करण प्रभाव वाले कोशिकाओं के संवर्धन को सक्षम करती हैं।

हाल ही में नवाचार और विधिगत अग्रिम

क्षेत्र तेजी से विकसित हो रहा है, नए तरीकों के साथ जो रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाते हैं, लागत को कम करते हैं और पूरक डेटा प्रकारों को एकीकृत करते हैं।

एकल सेल अनुक्रमण के साथ एकीकरण

सबसे रोमांचक हाल के घटनाक्रम में से एक एकल सेल readouts (जैसे Perturb-seq, CROP-seq) के साथ पूल स्क्रीन का युग्मन है। एक थोक जनसंख्या औसत को मापने के बजाय, ये दृष्टिकोण ट्रांसक्रिप्टोमीकिक, प्रोटेमिक या एपिगनोमिक प्रोफाइल को पर कब्जा करने के बाद अलग-अलग कोशिकाओं से पर कब्जा कर लेते हैं। इससे सेल-स्टेट-विशिष्ट प्रभाव, भिन्न प्रभाव में विषमता और आनुवंशिक परिवर्तनों के pleiotropic परिणाम प्रकट होते हैं। एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन विशेष रूप से विकास प्रक्रियाओं, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और कैंसर विकास का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान है जहां जनसंख्या औसत महत्वपूर्ण उप-लोकन को मुखौटा कर सकता है।

वेरिएंट प्रिओरिटाइजेशन के लिए मशीन लर्निंग

मशीन लर्निंग एल्गोरिदम अब HTFS वर्कफ़्लो के अभिन्न हैं। वे पूर्वानुमान लगाकर वेरिएंट लाइब्रेरी डिजाइन करने में मदद करते हैं जो उत्परिवर्तन को कार्यात्मक होने की संभावना है (उदाहरण के लिए, विकासवादी संरक्षण, प्रोटीन संरचना, या क्रोमैटिन राज्य पर आधारित)। स्क्रीनिंग के बाद, एमएल मॉडल बड़े पैमाने पर डेटासेट को एकीकृत कर सकते हैं जो वेरिएंट को पैथोजेनिक या सौम्य के रूप में वर्गीकृत करने के लिए, सत्यापन के लिए उम्मीदवारों को प्राथमिकता देते हैं, और अंतर्निहित तंत्र को प्रभावित करते हैं। डीप लर्निंग आर्किटेक्चर, जैसे कि संवहन तंत्रिका नेटवर्क (CNN) और बड़े पैमाने पर जीनोमिक डेटासेट पर प्रशिक्षित ट्रांसफार्मर, कार्यात्मक प्रभावों की भविष्यवाणी करने में प्रभावशाली सटीकता दिखायी है और प्रायोगिक स्क्रीन से निरंतर प्रतिक्रिया के माध्यम से परिष्कृत किया जा रहा है।

बहु-Omics एकीकरण

अन्य omics परतों के साथ HTS का संयोजन-जैसे प्रोटेमिक्स, मेटाबोमिक्स, या epigenomics-Vergonomics-Verticals, विभिन्न रूपों की एक पूरी तस्वीर प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, chromatin accessibility assays (जैसे, ATAC-seq) के साथ युग्मन MPRA यह प्रकट कर सकता है कि क्या नियामक संस्करण एक संदर्भ-निर्भर तरीके से बाध्यकारी ट्रांसक्रिप्शन कारक को प्रभावित करते हैं। ऐसे एकीकृत दृष्टिकोण जीनोटाइप और phenotype के बीच जटिल इंटरप्ले को समझने के लिए आवश्यक हैं।

अनुसंधान और चिकित्सा में अनुप्रयोग

HTFS पहले से ही जीनोमिक्स विविधता की व्याख्या करने और इसे नैदानिक अभ्यास में परिवर्तित करने की हमारी क्षमता को बदल देता है।

Uncertain महत्व के वेरिएंट्स की कार्यात्मक व्याख्या

नैदानिक जीनोमिक्स में एक प्रमुख बछड़े आनुवंशिक परीक्षणों में रिपोर्ट किए गए VUS का उच्च अनुपात है। HTFS व्यवस्थित रूप से विरासत में संबंधी विकारों के लिए प्रासंगिक जीनों में हजारों VUS के कार्यात्मक प्रभाव का आकलन कर सकता है, जैसे BRCA1 ], TP53], और CF]TR]]। कार्यात्मक सबूत प्रदान करके, ये स्क्रीन बेनिन या रोगजनक के रूप में भिन्नताओं को फिर से वर्गीकृत करने में मदद करती है, सीधे नैदानिक उपज और रोगी प्रबंधन में सुधार करती है।

फार्माकोजेनोमिक्स और ड्रग डेवलपमेंट

उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन आनुवंशिक वेरिएंट की पहचान कर सकती है जो दवा की प्रतिक्रिया को बदल देती है, जिससे प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी या प्रभावकारिता की कमी को सक्षम बनाया जा सकता है। दवा खोज में, एचटीएस का उपयोग कैंसर लक्ष्य जीन में प्रतिरोध उत्परिवर्तन के लिए किया जाता है, जिससे अगली पीढ़ी के अवरोधकों को डिजाइन करने में मदद मिलती है। इसके अतिरिक्त, दवा के लक्ष्यों के पूर्ण उत्परिवर्तनीय परिदृश्य को पूरा करके, शोधकर्ताओं ने अनुमान लगाया जा सकता है कि कैसे ट्यूमर प्रतिरोध को विकसित कर सकता है और तदनुसार संयोजन उपचार विकसित कर सकता है।

रोग तंत्र को समझना

रोग-रिलीवेंट सेल प्रकारों में बड़े भिन्न प्रकार के पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग (जैसे, न्यूरॉन्स, कार्डियोमायोसाइट्स, प्रतिरक्षा कोशिकाओं) कारण भिन्न रूपों को उजागर करता है और वे जिस रास्ते को प्रभावित करते हैं। उदाहरण के लिए, अध्ययनों ने कैंसर कोशिकाओं में आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए CRISPR स्क्रीन का उपयोग किया है, नए चिकित्सीय भेद्यता का खुलासा किया। न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों में, MPRAs ने बढ़ाने वाले उत्परिवर्तन को इंगित किया है जो कॉर्टिकल विकास के दौरान जीन विनियमन को बाधित करता है, जो कि ऑटिज़्म और schizophrenia जैसी स्थितियों में यांत्रिक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

वर्तमान सीमा और भविष्य दिशा

अपनी शक्ति के बावजूद, एचटीएफएस को कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है जिन्हें इसकी क्षमता को पूरा करने के लिए संबोधित किया जाना चाहिए।

स्केलेबिलिटी और लागत

जबकि डीएनए संश्लेषण और अनुक्रमण की लागत नाटकीय रूप से, बड़े पैमाने पर स्क्रीन को गिरा दिया गया है-विशेष रूप से उन लोगों को कस्टम सेल लाइनों, एकल सेल अनुक्रमण या जटिल phenotypic assays की आवश्यकता होती है - महंगा है। पुस्तकालय डिजाइन (जैसे, combinatorial संश्लेषण), स्वचालन और लघुकरण (जैसे, बूंद आधारित प्लेटफार्मों) में भविष्य में सुधार लागत को कम करेगा और इन प्रौद्योगिकियों तक पहुंच को लोकतांत्रिक बना देगा।

जैविक जटिलता और संदर्भ विशिष्टता

वेरिएंट प्रभाव सेल प्रकार, आनुवंशिक पृष्ठभूमि, पर्यावरण और epigenetic राज्य पर अत्यधिक निर्भर हो सकता है। एक संस्करण जो एक संदर्भ में सौम्य है वह दूसरे में रोगजनक हो सकता है। 3 डी जीनोम आर्किटेक्चर, स्प्लिसिंग विनियमन और ट्रांसलेशनल संशोधनों में जटिलता की परतें शामिल हैं जो सरलीकृत मॉडल सिस्टम में कब्जा करना मुश्किल है। ऑर्गनॉयड्स, सह-संस्कृतिओं और विवो स्क्रीनिंग में अग्रिम (जैसे, चूहों या ज़ेबराफ़िश में CRISPR का उपयोग करना) संदर्भ निर्भरता को संबोधित करना शुरू कर रहे हैं, लेकिन महत्वपूर्ण काम बनी हुई है।

डेटा विश्लेषण और व्याख्या

HTFS द्वारा उत्पन्न डेटा की सरासर मात्रा -अक्सर अरबों अनुक्रमण पढ़ता है - गुणवत्ता नियंत्रण, सामान्यीकरण और सांख्यिकीय कॉल के लिए मजबूत कम्प्यूटेशनल पाइपलाइनों की आवश्यकता होती है। ऑफ-टार्गी प्रभाव, पुस्तकालय पूर्वाग्रह, या स्टोकैस्टिक शोर के कारण झूठी सकारात्मकता को ध्यान से प्रबंधित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, अन्य जीनोमिक संसाधनों (जैसे, ENCODE] के साथ HTS डेटा को एकीकृत करना एक चुनौती है। मेटाडाटा को मानकीकृत करने के लिए प्रयास, सामान्य डेटा मॉडल विकसित करना और सार्वजनिक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रभाव के लिए इन महत्वपूर्ण परिणामों को साझा करना।

निष्कर्ष

उच्च-थ्रूपुट कार्यात्मक स्क्रीनिंग आधुनिक जीनोमिक्स के कोनेस्टोन के लिए एक विशेष तकनीक से चली गई है। आनुवंशिक विविधता के व्यवस्थित आकलन को सक्षम करके, ये विधियां कार्यात्मक तत्वों की खोज को तेज कर रही हैं, नैदानिक जीनोमिक्स के लिए वैरिएंट व्याख्या में सुधार कर रही हैं और रोग जीवविज्ञान में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर रही हैं। एकल-कोशिका संकल्प, मशीन लर्निंग एकीकरण और बहु-आधुनिक दृष्टिकोण जैसी उभरती हुई तकनीकों ने मानव स्वास्थ्य को कैसे आकार देने की हमारी समझ को और अधिक परिष्कृत करने का वादा किया है। चूंकि लागत कम हो जाती है और विधियां अधिक सुलभ हो जाती हैं, एचटीएफएस शोधकर्ताओं और चिकित्सकों के लिए एक तेजी से आवश्यक उपकरण बन जाएगा, जिससे जीनोटाइप और phenotype के बीच अंतर को दूर करने में मदद मिलेगी।

कार्यात्मक जीनोमिक्स प्रौद्योगिकियों के व्यापक अवलोकन के लिए, प्रकृति समीक्षा आनुवंशिकी में कैनवर एट अल (2017) द्वारा समीक्षा देखें ]. वैरिएंट व्याख्या पर अतिरिक्त संसाधन ]ClinVar डेटाबेस ]] और ]NIH Genome Sequencing Program]] के माध्यम से मिल सकते हैं।