दीर्घकालिक सेल संस्कृति में संवेदना को रोकने के लिए रणनीतियां

कोशिकाविज्ञान

दीर्घकालिक सेल संस्कृतियां ड्रग खोज, विषाक्तता, पुनर्योजी चिकित्सा और बुनियादी जीवविज्ञान में अनगिनत प्रयोगों की रीढ़ बनाती हैं। फिर भी सभी निरंतर रेखाएं अंततः एक मूलभूत बाधा का सामना करती हैं: सेलुलर सेंसेंस। सेंसेंस सेल प्रोलिस्ट्रेशन की एक स्थिर गिरफ्तारी है जो विभिन्न आंतरिक और बाहरी तनावों के जवाब में होती है। क्विएसेंस के विपरीत, जिसे रिवर्स किया जा सकता है, सेंसेंट कोशिकाएं चयापचय रूप से सक्रिय रहती हैं लेकिन स्थायी रूप से विभाजित होने से रोकती हैं। यह स्थिति जीन अभिव्यक्ति को बदल देती है, एक समर्थक भड़काऊ milieu को गुप्त करती है जिसे सेंसेंस-एसोसिएट्रिकल फेनोटाइप (Sathesis) या s of the stepspenses) के रूप में विकसित करने की पहली बार इस्तेमाल किया जाता है।

प्रमुख ट्रिगर और सेन्सेंस के पथमार्ग

टेलोमेरे शॉर्टनिंग और प्रतिकृति Senescence

डीएनए प्रतिकृति के प्रत्येक दौर में टेलोमेरेस को छोटा कर दिया जाता है - क्रोमोसोम के सिरों पर सुरक्षात्मक टोपी। जब टेलोमेरेस गंभीर रूप से कम हो जाते हैं, तो डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (DDR) p53 और p21 को सक्रिय करती है, जिससे स्थायी सेल चक्र गिरफ्तारी होती है। यह प्रतिकृति संवेदनशीलता अधिकांश मानव सोमैटिक कोशिकाओं के लिए एक प्राकृतिक सीमा है, जिसमें पर्याप्त टेलोमेरेस गतिविधि की कमी होती है। संस्कृति में, टेलोमेरे कटाव उप-उत्तेजित स्थितियों के तहत तेजी से बढ़ता है, जिससे टेलोमेरे रखरखाव प्रोलिफेरेटिव जीवनकाल को बढ़ाने के लिए एक प्राथमिक लक्ष्य बन जाता है।

Oncogene-Induced Senescence (OIS)

Ras जैसे ऑनकोजेन्स का सक्रियण ] या ]BRAF] P16 ^INK4a/RB पथमार्ग के माध्यम से संवेदनशीलता को ट्रिगर कर सकते हैं। संस्कृति में, ऑनकोजेन्स (जैसे, सहज उत्परिवर्तन के माध्यम से) की आकस्मिक सक्रियण की आवश्यकता होती है। OIS एक ट्यूमर-सप्रेसिव तंत्र के रूप में कार्य करता है लेकिन एक समान होने पर अवांछनीय है, उच्च विकास संस्कृति की आवश्यकता होती है।

ऑक्सीडेटिव तनाव और डीएनए डैमेज

सामान्य चयापचय या संस्कृति की स्थिति से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (जैसे उच्च ऑक्सीजन तनाव, प्रकाश एक्सपोजर) डीएनए घावों, प्रोटीन ऑक्सीकरण और लिपिड peroxidation का कारण बनती हैं। लगातार ऑक्सीडेटिव क्षति डीडीआर और पी 53 को सक्रिय करती है, जो समय से पहले संवेदनशीलता को चलाती है। वायुमंडलीय ऑक्सीजन (~ 20%) पर मानक इनक्यूबेटर शारीरिक स्तर (1–5%), कई सेल प्रकारों में सेंसेंसेंसी को तेज करने की तुलना में उच्च ऑक्सीडेटिव तनाव को लागू करते हैं।

Epigenetic Deregulation

हिस्टोन संशोधन और डीएनए methylation पैटर्न संस्कृति की उम्र के साथ बदल जाते हैं। विषमकोण चिह्नों की कमी, विकासात्मक जीनों की अभिव्यक्ति, और परिवर्तित क्रोमैटिन रीमॉडलिंग से टेलोमेरे की लंबाई से स्वतंत्र रूप से संवेदनशीलता मार्ग को सक्रिय कर सकते हैं। Epigenetic अस्थिरता समय के साथ जमा होती है और अपर्याप्त संस्कृति मीडिया द्वारा exacerbated है।

लंबी अवधि की संस्कृतियों में संवेदना को रोकने के लिए रणनीतियाँ

1. Telomerase सक्रियण और hTERT Expression

प्रतिकृति से बचने का सबसे सीधा तरीका है टेलोमेरेस गतिविधि को बहाल करना। कई सेल प्रकार - जिनमें प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट, उपकला कोशिकाओं और मेसेन्चमल स्टेम सेल शामिल हैं - इसे टेलोमेरेस (एचटीईआरटी) के उत्प्रेरक सबुन की संरचनात्मक अभिव्यक्ति द्वारा याद किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण सैकड़ों आबादी वाले डब्लिंग्स पर टेलोमेरे की लंबाई को बनाए रखता है, बशर्ते अन्य संस्कृति की स्थितियां अनुकूलित हो। एचटीईआरटी अभिव्यक्ति स्वयं मैकेनिक द्वारा परिवर्तन का कारण नहीं बनती है; यह केवल प्रोलिफेरेटिव सीमा को बढ़ाता है। शोधकर्ता अक्सर एचटीईटीटीएनएनएल (Nutol) को रोकने के लिए एक व्यापक विकल्प का उपयोग करते हैं।

2. संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन करना

इन विट्रो पर्यावरण के हर पैरामीटर से संवेदनशीलता को प्रभावित होता है। निम्नलिखित समायोजन प्रभावी साबित हुए हैं:

कम ऑक्सीजन तनाव 2-5 % O2 (अधिक ऊतकों के लिए नर्मोक्सिया) में कोशिकाओं को कम करने के कारण ROS उत्पादन को कम किया जाता है, हाइपोक्सिया-inducible कारकों को स्थिर करता है, और senescence में देरी करता है। कई स्टेम सेल और प्राथमिक रेखाएं हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत अपनी उम्र को काफी बढ़ाती हैं।
Antioxidant पूरकता. एन एसिटिलीसस्टीन, विटामिन ई, या ग्लूटाथियोन पूर्ववर्ती जैसे योजक यौगिकों आरओएस को बदला और टेलोमेरेस की रक्षा कर सकते हैं। हालांकि, अत्यधिक उच्च खुराक विषाक्त हो सकती है; titration आवश्यक है।
] उच्च गुणवत्ता वाले मीडिया और सीरम अनुकूलित ग्लूकोज, ग्लूटामाइन और पाइरूवेट स्तर के साथ ताजा तैयार, एंडोटॉक्सिन मुक्त मीडिया का उपयोग चयापचय तनाव को कम कर देता है। भ्रूण बोवेन सीरम (FBS) बैच विविधताएं संवेदनशीलता को प्रभावित करती हैं; परिभाषित सीरम-मुक्त योगों या कम-FBS की खुराक का उपयोग करके पुनःप्रवर्तन क्षमता में सुधार कर सकते हैं।
pH और osmolality नियंत्रण. तंग बाइकार्बोनेट बफरिंग के साथ लगातार मध्यम परिवर्तन (Co2 incubators के बाहर जब HEPES का उपयोग) अम्लीकरण और osmotic झटके को रोकने के लिए जो गिरफ्तारी को ट्रिगर करते हैं।
]Surface कोटिंग्स और बाह्य सेलुलर मैट्रिक्स। जब कोशिकाओं को सब्सट्रेट पर उगाया जाता है तो संवेदना में देरी होती है जो उनके मूल वातावरण - कोल्जेन, लैमिनिन या फ़िब्रोनेक्टिन कोटिंग की नकल करते हैं। उदाहरण के लिए, decellularized मैट्रिक्स पर खेती की गई मेसेन्चमल स्टेम सेल प्लास्टिक पर उन लोगों की तुलना में उच्च प्रोलिफेरेटिव क्षमता बनाए रखते हैं।

लंबे समय तक गुजरने के लिए संस्कृति की स्थिति को अनुकूलित करने पर विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, Current प्रोटोकॉल in सेल बायोलॉजी ] गाइडलाइन व्यावहारिक बेंचमार्क प्रदान करता है।

3. आनुवंशिक संशोधन Beyond Telomerase

जबकि एचटीईआरटी सबसे आम टीकाकरण उपकरण है, अन्य आनुवंशिक हस्तक्षेप पूरक मार्गों के माध्यम से संवेदनशीलता से निपटने के लिए कर सकते हैं:

]]Overexpression of anti-senescence जीन. BMI1 ] (B-cell-specific Moloney murine leukemia वायरस एकीकरण स्थल 1) ]INK4a ] / [FLT: 6]ARRF locus, p16 ^]]INK4a]Bobium.
]]]Senescence-associated जीन के नॉकडाउन। Silencing p21]] या p16[ shRNA या CRISPR-i का उपयोग करके कोशिकाओं को गिरफ्तारी से छोड़ सकते हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग सावधानी से किया जाना चाहिए क्योंकि यह परिवर्तन के जोखिम को बढ़ा सकता है।
CRISPR/Cas9 आधारित दृष्टिकोण. टेलोमेरेज प्रमोटरों का सटीक संपादन या टेलोमेरे-एसोसिएटेड क्षति मार्गों की मरम्मत अब संभव है। उदाहरण के लिए, ATM ]]] को बाधित करने के लिए, kinase डीएनए क्षति चेकपॉइंट को ब्रोग कर सकता है, जो लघु टेलोमेरेस के बावजूद निरंतर विभाजन की अनुमति देता है - लेकिन जीनोम स्थिरता की लागत पर। सबसे संतुलित रणनीतियों p53 पथमार्ग मॉडुलन के साथ टेलोमेरेस रिएक्टिवेशन को जोड़ती है।

4। छोटे अणु सेनोलिटिक्स और सेन्सेंस रेवर्सल

संवेदनशीलता को रोकने के बजाय, कुछ यौगिक चयनात्मक रूप से से सेंसेंट कोशिकाओं को हटा सकते हैं या एसएएसपी को अवरुद्ध कर सकते हैं। ये एक प्रोलिफेरेटिव संस्कृति को बनाए रखने के लिए कम उपयोगी हैं क्योंकि वे गिरफ्तार कोशिकाओं को साफ़ करते हैं लेकिन विकास को बहाल नहीं करते हैं। हालांकि, जब पूर्व शर्त के साथ संयुक्त हो जाता है, तो वे समग्र संस्कृति स्वास्थ्य में सुधार कर सकते हैं:

Dasatinib + quercetin. यह संयोजन विवो और इन विट्रो में सेंसेंट सेल बोझ को कम करता है, लेकिन यह कुछ प्राथमिक संस्कृतियों के लिए साइटोटोक्सिक है।
Rapamycin. MTOR को रोकने के द्वारा, rapamycin कई सेल प्रकारों में senescence देरी, SASP को कम कर देता है, और ऑटोफैगि को बढ़ाता है। यह सीधे टेलोमेरे को छोटा करने से रोकता नहीं है लेकिन अन्य senescence hallmarks की शुरुआत को स्थगित करता है।
Metformin. अपने विरोधी बुढ़ापे प्रभाव के लिए जाना जाता है, मेथफॉर्मिन माइटोकॉन्ड्रियल ROS को कम करता है और AMPK को सक्रिय करता है, जिससे मेसेन्चमल स्टेम सेल और एंडोथेलियल प्रोजेनेटर्स में सेंसेंस को धीमा कर देता है।
Resveratrol और nicotinamide riboside. ये NAD + precursors sirtuin गतिविधि को बढ़ावा देते हैं, जो विषमकोण और देरी epigenetic senescence बनाए रख सकते हैं।

सेनोथेरेपी यौगिकों का व्यापक अवलोकन में दिया गया है।

लंबी अवधि की संस्कृति का प्रैक्टिकल डेली मैनेजमेंट

यहां तक कि अनुकूलित स्थितियों और आनुवंशिक उपकरणों के साथ, दिन-प्रतिदिन की हैंडलिंग यह निर्धारित करती है कि क्या संवेदनशीलता खाड़ी में रखी गई है। निम्नलिखित परिचालन दिशानिर्देश मजबूत संस्कृतियों को बनाए रखने में मदद करते हैं:

लिमिट मार्ग संख्या प्राथमिक लाइनों के लिए, प्रारंभिक मार्गों को रोबोप्रेजर्व करें और आवश्यकतानुसार विस्तार करें। जीवन काल की निगरानी के लिए एक मार्ग-ट्रैकिंग सिस्टम (सहनात्मक आबादी डबलिंग, न सिर्फ मार्ग संख्या) का उपयोग करें।
]Avoid over confluence. संगमणकता और संवेदनशीलता को प्रेरित करने में संपर्क अवरोध और पोषक तत्व कमी। जब कोशिकाएं 70-80% तक पहुंचती हैं, तो सबसंस्कृति से परे नहीं।
]Use सौम्य विघटन विधि. ट्रिप्सिन / EDTA जोखिम कम से कम होना चाहिए। संवेदनशील कोशिकाओं के लिए accutase या गैर-enzymatic विघटन बफर का उपयोग करने पर विचार करें। लंबे समय तक ट्रिप्सिनाइजेशन सतह रिसेप्टर्स को नुकसान पहुंचाता है और तनाव प्रतिक्रिया को ट्रिगर करता है।
Monitor तनाव मार्कर Senescence-associated βgalactosidase (SA-β-gal) या qPCR के लिए ]p21]] और p16]]] प्रारंभिक संकेतों का पता लगा सकते हैं। व्यापक गिरफ्तारी होने से पहले सुधारात्मक कार्रवाई लागू करें।
Cryopreservation best practice.] उच्च-viability फ्रीजिंग मीडिया (जैसे 10% DMSO + 90% FBS), नियंत्रित-rate फ्रीजिंग या isopropanol कंटेनरों का उपयोग करें, और तरल नाइट्रोजन वाष्प चरण में स्टोर करें। DMSO विषाक्तता के बिना व्यवहार्य thawing महत्वपूर्ण है।
बैच टेस्ट सीरम और मीडिया। एक नए बहुत से करने से पहले, दोगुनी समय और संवेदनशीलता घटना की तुलना के लिए 3-5 मार्गों पर एक वृद्धि वक्र प्रदर्शन।

भविष्य निर्देश: अगली पीढ़ी के दृष्टिकोण

क्षेत्र पारंपरिक 2D मोनोलायर संस्कृति से परे चल रहा है। तीन आयामी प्रणालियों जैसे ऑर्गनोइड, स्पॉरोइड्स, और बायोरेक्टर संस्कृतियों में अक्सर देरी से संवेदनशीलता का प्रदर्शन होता है क्योंकि वे विवो आर्किटेक्चर और पोषक तत्वों के ढाल में बेहतर नकल करते हैं। माइक्रोफ्लोडिक perfusion डिवाइस अपशिष्ट को हटा सकते हैं और लगातार ताजा माध्यम की आपूर्ति कर सकते हैं, तनाव को कम कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (iPSC) में असीमित आत्म-नवीकरण क्षमता होती है और इसे वांछित सोमैटिक कोशिकाओं में अलग किया जा सकता है, प्रभावी रूप से प्रारंभिक लाइन की संवेदनशीलता को प्रभावित करती है। निर्देशन अलग-अलगता और epigenetic कायाकल्प के साथ iPSC प्रौद्योगिकी का संयोजन जल्द ही अनुसंधान प्रदान कर सकता है।

एक और रोमांचक दिशा Yamanaka कारकों (Oct4, Sox2, Klf4, C-Myc) की क्षणिक अभिव्यक्ति का उपयोग आंशिक रूप से कोशिकाओं को फिर से शुरू करने के लिए है, पहचान को मिटाए बिना epigenetic उम्र को फिर से निर्धारित करना। फाइब्रोब्लास्ट में अध्ययनों से पता चला है कि संक्षिप्त, चक्रीय अभिव्यक्ति से संवेदनशीलता मार्करों को कम कर देता है और प्रतिकृति जीवनकाल को बढ़ाता है। यह "epigenetic कायाकल्प" दृष्टिकोण अभी भी विकास में है लेकिन टेलोमेरेस अमरीकरण के लिए एक गैर-genetic विकल्प प्रदान करता है।

निष्कर्ष

दीर्घकालिक सेल संस्कृतियों में संवेदनशीलता को रोकने के लिए एक स्तर की रणनीति की आवश्यकता होती है जो टेलोमेरे जीवविज्ञान, ऑक्सीडेटिव तनाव, संस्कृति पर्यावरण और आनुवंशिक स्थिरता को संबोधित करती है। कोई भी समाधान सार्वभौमिक रूप से काम नहीं करता है; सर्वोत्तम परिणाम अनुकूलित कम ऑक्सीजन स्थितियों, उच्च गुणवत्ता वाले मीडिया, कोमल हैंडलिंग और नियमित निगरानी के साथ टेलोमेरेस सक्रियण (एचटीईआरटी के माध्यम से) के संयोजन से आते हैं। शोधकर्ताओं को कोशिकाओं के अंतिम उपयोग पर विचार करना चाहिए - कार्यात्मक assays, जैव उत्पादन, या प्रत्यारोपण के लिए - और तदनुसार रोकथाम दृष्टिकोण को अनुरूपित करना चाहिए। इन तकनीकों को एकीकृत करके, वैज्ञानिक सैकड़ों आबादी वाले उपायुक्त परिणामों के लिए स्वस्थ, प्रोलिफेरेटिव संस्कृतियों को बनाए रख सकते हैं।