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क्रोमैटोग्राफी के सिद्धांत
क्रोमैटोग्राफी एक स्थिर चरण और एक मोबाइल चरण के बीच उनके अंतर वितरण के आधार पर अणुओं को अलग करती है। स्थिर चरण एक ठोस समर्थन पर लेपित एक ठोस या तरल हो सकता है, जबकि मोबाइल चरण एक तरल या गैस है जो प्रणाली के माध्यम से नमूना ले जाती है। यौगिक स्थिर चरण के साथ adsorption], ]partitioning], ]ion exchange, या Size exclusion, जिससे उन्हें जैविक परिपक्वता के लिए अलग-अलग बिजली की खोज की जा सकती है।
कई मापदंडों को अलग-अलग दक्षता को प्रभावित करते हैं: कॉलम आयाम , ] कण आकार , प्रवाह दर ], और मोबाइल चरण संरचना ] आधुनिक उपकरण तेजी से और अधिक कुशल अलगाव हासिल करने के लिए उच्च दबाव का उपयोग करते हैं। उदाहरण के लिए, अल्ट्रा उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (UHPLC) 15,000 psi से अधिक दबावों पर काम करती है, उच्च संकल्प को बनाए रखते हुए रन टाइम को कम करती है।
मेटाबोलोमिक्स के लिए प्रमुख क्रोमैटोग्राफी तकनीक
गैस क्रोमैटोग्राफी (GC)
GC ] के लिए आदर्श है, volatile और ]: थर्मल स्थिर metabolites. नमूने vaporized हैं और एक स्तंभ के माध्यम से पारित कर रहे हैं, एक तरल स्थिर चरण के साथ लेपित, एक निष्क्रिय गैस (जैसे, हीलियम) मोबाइल पहचान चरण के रूप में. Derivatization अक्सर ध्रुवीय metabolites अस्थिर बनाने के लिए आवश्यक है - आम अभिकर्मकों में शामिल हैं silylating एजेंट और methylating यौगिकों. GC बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-MS) के साथ मिलकर Electron alt] है।
तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी)
LC हैंडल ]गैर-वोलाटाइल और ]: थर्मल लैबाइल यौगिकों. कई metabolomics अध्ययन का उपयोग reversed-phase (RP) LC गैर ध्रुवीय के लिए C18 स्तंभों के साथ मध्यम ध्रुवीय अणुओं को कवर करने के लिए, या हाइड्रोफिलिक इंटरेक्शन क्रोमैटोग्राफी (HILIC) ] अत्यधिक ध्रुवीय metabolites के लिए। अल्ट्रा उच्च-उच्च-तरल तरल क्रोमैट को कवर करता है।
केशिका वैद्युतकणसंचलन (CE)
CE उनके ]electrophoretic गतिशीलता पर आधारित आयनों को अलग करता है, जो एक विद्युत क्षेत्र के तहत एक संकीर्ण केशिका में है। यह विशेष रूप से ] के लिए प्रभावी है अत्यधिक ध्रुवीय ] और भारित मेटाबोलाइट्स ], जैसे कि न्यूक्लियोटाइड्स, कार्बनिक अम्ल और फॉस्फोरिलेटेड यौगिकों। सीई-एमएस उत्कृष्ट अलगाव क्षमता और कम नमूना खपत प्रदान करता है, हालांकि यह आमतौर पर एलसी या जीसी से कम उपयोग किया जाता है।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ क्रोमैटोग्राफी को एकीकृत करना
Hyphenated तकनीक - जीसी-एमएस, एलसी-एमएस, सीई-एमएस - मेटाबोमिक्स की रीढ़ हैं। क्रोमैटोग्राफिक अलगाव आयन दमन को कम करता है और सामूहिक स्पेक्ट्रोमीटर को व्यक्तिगत रूप से यौगिकों का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRMS) (जैसे, Q-TOF, Orbitrap) आत्मविश्वासी मेटाबोलाइट पहचान के लिए सटीक मास माप प्रदान करता है। ]Tandem मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS/MS) [FLT: 3] विखंडन पैटर्न के माध्यम से संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करता है। [FLT-Mate]
मेटाबोलोमिक्स वर्कफ़्लो
नमूना तैयारी
उचित नमूना तैयारी महत्वपूर्ण है। मेटाबोलिक तेजी से बदल जाते हैं, इसलिए चयापचय ] quenched तुरंत (जैसे, ठंडी मेथनॉल)। ] एक्सट्रैक्शन द्विपक्षीय तरल तरल तरल तरल तरल तरल निकासी (जैसे, मेथनॉल / क्लोरोफॉर्म / पानी) जैसे तरीके अलग ध्रुवीय और गैर ध्रुवीय भिन्नता। नमूना Drivatization GC-MS या प्रोटीन प्रीपिच LC-TR के लिए सामान्य चरण हैं।
पृथक्करण और जांच
क्रोमैटोग्राफी की स्थिति को ब्याज के मेटाबोलाइट वर्गों के अनुसार अनुकूलित किया गया है। उदाहरण के लिए, पानी / एसिटोनिट्राइल के ढाल और 0.1% फोरमिक एसिड सूट सबसे लिपिडमिक्स के साथ एक C18 कॉलम। HILIC कॉलम ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स के लिए उच्च कार्बनिक सामग्री मोबाइल चरणों का उपयोग करते हैं। स्तंभ तापमान, प्रवाह दर और इंजेक्शन की मात्रा को चोटी क्षमता और पुनर्जन्म को अधिकतम करने के लिए समायोजित किया जाता है।
डेटा प्रोसेसिंग
रॉ क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा peak Detection], alignment] नमूनों के पार, और normalization (जैसे, कुल आयन गिनती या आंतरिक मानक का उपयोग करता है)। XCMS, MZmine, और मिश्रित डिस्कवर जैसे उपकरण इन चरणों को स्वचालित करते हैं। Statistical विश्लेषण] - प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA), कम से कम वर्गों के भेदभाव विश्लेषण (PLS-D) के बीच HATF]
मेटाबोलोमिक्स दृष्टिकोण
Untargeted Metabolomics
Untargeted metabolomics का उद्देश्य पहले ज्ञान के बिना संभव के रूप में कई चयापचयों का पता लगाना है। Global profiling] चयापचय perturbation के बारे में परिकल्पना उत्पन्न करता है। क्रोमैटोग्राफी व्यापक या एकाधिक स्तंभों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, एक दोहरी कॉलम दृष्टिकोण (RP-LC और HILIC) दोनों ध्रुवीय और गैर ध्रुवीय यौगिकों को कवर करता है। अंटार्कटिक डेटा अर्द्ध मात्रात्मक हैं और सावधानी से मान्यकरण की आवश्यकता होती है।
लक्षित मेटाबोलोमिक्स
लक्षित मेटाबोमिक्स चयापचयों के एक पूर्वनिर्धारित सेट को मापने पर केंद्रित है, अक्सर जैवचिह्नक। Stable isotope-labeled आंतरिक मानकों पूर्ण मात्रा में बदलाव की अनुमति देते हैं। ट्रिपल क्वाड्रूपोल उपकरणों पर एमआरएम उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता प्रदान करता है। क्रोमैटोग्राफी लक्ष्य यौगिकों के लिए अनुकूलित है, अक्सर उच्च throughput के लिए छोटे रन समय के साथ।
बायोमार्कर डिस्कवरी में क्रोमैटोग्राफी की भूमिका
डिस्कवरी चरण
जैवमार्कर खोज में, क्रोमैटोग्राफी रोग से संबंधित चयापचयों को प्रकट करने के लिए जटिल जैविक तरल पदार्थ (प्लामा, मूत्र, ऊतक निकालने) को अलग करती है। उदाहरण के लिए, ]branched-chain अमीनो एसिड (BCAAs) को LC-MS का उपयोग करके इंसुलिन प्रतिरोध के शुरुआती मार्करों के रूप में पहचाना गया। अंटार्जित अध्ययनों में कोहोर्ट्स की तुलना की जाती है, और सैकड़ों उम्मीदवार सुविधाओं को सांख्यिकीय फ़िल्टरिंग के माध्यम से कुछ दर्जनों तक कम किया जाता है।
मान्यता चरण
जैव-markers को बड़े, स्वतंत्र कोहोर्ट में मान्य किया जाना चाहिए। क्रोमैटोग्राफी ]]Reproducibility] को मान्यकरण के लिए आवश्यक है। अवधारण समय स्थिरता और जन सटीकता सुसंगत पहचान सुनिश्चित करती है। Method वैधता ] में रैखिकता, पता लगाने की सीमा, परिशुद्धता और सटीकता का आकलन शामिल है। नैदानिक अनुवाद से पहले एक मान्य assay आवश्यक है।
नैदानिक अनुवाद
नैदानिक निदान के लिए अनुसंधान से संक्रमण को मजबूत, उच्च-थ्रूपुट विधियों की आवश्यकता होती है। ]homocysteine (LC-MS/MS) और ]vitamin D metabolites (LC-MS) पहले से ही नैदानिक प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है। स्वचालन (जैसे, ऑनलाइन SPE LC-MS) के साथ मिलकर मैनुअल हैंडलिंग को कम करता है और throughput को बढ़ाता है।
रोग जैवचिह्नक में केस स्टडीज
कैंसर मेटाबोलोमिक्स
कैंसर कोशिकाओं में चयापचय को बदल दिया गया है - Warburg प्रभाव (aerobic ग्लाइकोलिसिस)। Chromatography ने उन्नत लैक्टोटेट, परिवर्तित टीसीए चक्र मध्यवर्ती की खोज में सक्षम बनाया और न्यूक्लियोटाइड चयापचय में परिवर्तन किया। उदाहरण के लिए, 2-hydroxyglutarate GC-MS द्वारा पता लगाया गया IDH-mutant gliomas में एक ऑनकोमेटोलाइट है। LC-MS का उपयोग करके लिपिडोमिक्स ने स्तन और प्रोस्टेट कैंसर में फॉस्फोलिपिड प्रोफाइल को बदल दिया है।
मधुमेह और चयापचय सिंड्रोम
मेटाबोलिक सिंड्रोम में लिपिड, अमीनो एसिड और ग्लूकोज का अपवित्रता शामिल है। क्रोमैटोग्राफी अध्ययन ने BCAAs], ]aromatic अमीनो एसिड (tyrosine, phenylalanine), और acylcarnitine]]]] टाइप 2 मधुमेह के पूर्वानुमान के रूप में पहचाना है। LC-MS सेरामाइड और diacylglyols लिंक lipid चयापचय की रूपरेखा इंसुलिन प्रतिरोध के लिए लिंक। ये मार्कर अब बड़े पैमाने पर कोहोर्ट में मान्य किए जा रहे हैं।
न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग
अल्जाइमर, पार्किंसंसन, और एएलएस में मस्तिष्क और परिधि में चयापचय संबंधी विकार शामिल हैं। Lipidomics का उपयोग करके LC-MS ने cerebrospinal तरल पदार्थ में स्पोलिपिड्स और स्टेरोल में बदलावों का खुलासा किया। ]Polyamine स्तर [[FLT: 3]] (spermidine, putrescine) अल्जाइमर में बदल दिया जाता है, जिसे HILIC-MS द्वारा पता लगाया जाता है। Chromatographic विधियां चयापचय हस्ताक्षरों की पहचान करने में मदद करती हैं जो संज्ञानात्मक गिरावट के साथ संबंध रखती हैं।
चुनौतियां और समाधान
मैट्रिक्स प्रभाव और आयन दमन
सह-संक्रमण यौगिकों MS में आयनीकरण को दबा सकते हैं। बीटर क्रोमैटोग्राफिक रेज़ोल्यूशन सह-उन्नयन को कम करता है। isotope-labeled आंतरिक मानकों का उपयोग [] मैट्रिक्स प्रभाव के लिए क्षतिपूर्ति करता है। दो आयामी क्रोमैटोग्राफी (एलसी × एलसी) या ऑफलाइन भिन्नता नमूने को और साफ कर सकती है।
डेटा की पुनरुत्थान
इंटर-लैब वैरिएबिलिटी एक बाधा बनी हुई है। मानकीकृत प्रोटोकॉल , गुणवत्ता नियंत्रण नमूने, और cross-श्रमिक अध्ययन (जैसे, NIST SRM 1950 का उपयोग) Reproduability में सुधार। alkylamines]] या अन्य कैलिब्रेंट रनों के पार डेटा को संरेखित करने में मदद करता है।
बड़े पैमाने पर अध्ययन
जनसंख्या स्तर के मेटाबोमिक्स के लिए हजारों नमूनों को संभालने की आवश्यकता होती है। ऑटोमेटेटेड नमूना तैयारी (robotics) और U(H)PLC with short Column] (जैसे, 5-मिनट ग्रेडिएंट) उच्च थ्रूपुट सक्षम करते हैं। Batch सुधार एल्गोरिदम (जैसे, क्यूसी आधारित सुधार) पता लंबे अनुक्रमों पर बहती है।
भविष्य आउटलुक
उच्च-रिसोल्यूशन पृथक्करण
स्तंभ प्रौद्योगिकी (जैसे, ]sub-2 μm कोर-शेल कण ) और ion गतिशीलता spectrometry (IMS) collisional क्रॉस-सेक्शन के आधार पर अलगाव का आयाम जोड़ते हैं। LC-IMS-MS isomers को हल कर सकते हैं और चरम क्षमता बढ़ा सकते हैं। Comprehensive द्वि-आयामी GC (GC × GC) volatile के लिए कर्षण प्राप्त कर रहा है।
स्वचालन और लघुकरण
माइक्रोफ्लाइडिक डिवाइस और डिजिटल माइक्रोफ्लिडिक्स को ऑन-चिप नमूना तैयारी और अलगाव के लिए विकसित किया जा रहा है। स्वचालित online SPE-LC-MS] सिस्टम मैनुअल चरणों को कम करते हैं, जिससे Reproducibility बढ़ जाती है। ये तकनीकें नैदानिक प्रयोगशालाओं के लिए क्रोमैटोग्राफी को अधिक सुलभ बनाती हैं।
मशीन लर्निंग के साथ एकीकरण
मशीन लर्निंग एल्गोरिदम प्रतिधारण समय की भविष्यवाणी करते हैं, एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा से मेटाबोलाइट एनोटेशन में सहायता करते हैं, और बड़े डेटासेट में पैटर्न की पहचान करते हैं। बड़े पैमाने पर वर्णक्रमीय जानकारी के साथ क्रोमैटोग्राफी रिटेंशन डेटा का संयोजन जैवमार्कर पहचान में विश्वास को बेहतर बनाता है। Deep learning मॉडल भी इष्टतम अलगाव की स्थिति का सुझाव दे सकते हैं।
निष्कर्ष
क्रोमैटोग्राफी मेटाबोलोमिक्स और बायोमार्कर खोज के लिए एक अनिवार्य उपकरण बनी हुई है। नैदानिक बायोमार्कर को मान्य करने के लिए हजारों मेटाबोलिकों को अलग करने से, क्रोमैटोग्राफिक तकनीक संकल्प, पुनर्जन्म और मात्रात्मक सटीकता की आवश्यकता प्रदान करती है। जैसा कि इंस्ट्रूमेंटेशन विकसित होता है - उच्च दबाव, बेहतर स्तंभ रसायन विज्ञान और आयन गतिशीलता और स्वचालन के साथ एकीकरण - क्रोमैटोग्राफी सटीक दवा और चयापचय phenotyping में प्रगति को जारी रखेगा। शोधकर्ताओं को प्रत्येक तकनीक (जीसी, एलसी, सीई) और डिज़ाइन वर्कफ़्लो की ताकतों पर विचार करना चाहिए जो डेटा की गुणवत्ता को बनाए रखते हुए मेटाबोलोम के कवरेज को अधिकतम करता है।
आगे पढ़ने के लिए, ]Nature Metabolomics विषय पृष्ठ , ]Chromatography ऑनलाइन संसाधन , और हाल ही में जैवमार्कर खोज में LC-MS पर समीक्षा ]. इसके अतिरिक्त, ]Human Metabolome डेटाबेस (HMDB) संदर्भ स्पेक्ट्रा और पथमार्ग जानकारी प्रदान करता है, और Metabolomics Workbench[FLT:]]