संस्कृति में सेल पृथक्करण के लिए चुंबकीय मोती का उपयोग करना

चुंबकीय मनके आधारित सेल पृथक्करण का परिचय

सेल अलगाव आधुनिक जीवविज्ञान और चिकित्सा में एक कोनेस्टोन तकनीक है, जिससे शोधकर्ताओं को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण, संस्कृति, या चिकित्सीय उपयोग के लिए विषम मिश्रण से विशिष्ट सेल आबादी को अलग करने में सक्षम बनाया गया है। विभिन्न अलगाव प्रौद्योगिकियों में, चुंबकीय मनका आधारित विधियों ने गति, सादगी और कोमल हैंडलिंग के संयोजन के कारण व्यापक गोद लेने की क्षमता हासिल की है। ये विधियां सुपरपैरामैग्नेटिक माला पर निर्भर करती हैं जो लक्षित सेल सतह मार्करों से बांधती हैं, जिससे चुंबकीय क्षेत्र के तहत कुशल अलगाव की अनुमति मिलती है। पिछले दो दशकों में, चुंबकीय अलगाव एक आला प्रयोगशाला उपकरण से बुनियादी अनुसंधान, नैदानिक निदान और सेल थेरेपी विनिर्माण में उपयोग की जाने वाली एक मानक तकनीक में विकसित हुई है।

चुंबकीय मोती के मूल

चुंबकीय मोती आम तौर पर नैनोमीटर से लेकर माइक्रोमीटर तक व्यास वाले गोलाकार कण होते हैं, जो चुंबकीय नैनोकणों (अक्सर लौह ऑक्साइड, Fe_]3]O_]]4] या γ-Fe]]]2O]]]]]]]. एक प्रमुख संपत्ति सुपरपराग्नेटिज्म है: मोती केवल एक बाहरी चुंबकीय क्षेत्र के संपर्क में रहने पर मजबूत चुंबकन प्रदर्शित करता है और अक्सर एक्यूमिनलिटी के बाद कोई अवशिष्ट क्षमता नहीं होती है।

चुंबकीय सेल पृथक्करण के सिद्धांत

अलगाव प्रक्रिया को दो मुख्य दृष्टिकोणों में विभाजित किया जा सकता है: सकारात्मक चयन और नकारात्मक (विलोचन) चयन। सकारात्मक चयन में, मोती को एंटीबॉडी के लिए जोड़ा जाता है जो लक्ष्य सेल आबादी को पहचानते हैं। ऊष्मायन के बाद, बीड-बाउंड कोशिकाएं एक चुंबकीय क्षेत्र द्वारा कब्जा कर ली जाती हैं, जबकि अपरिवर्तित कोशिकाएं खारिज हो जाती हैं। नकारात्मक चयन में, मोती अवांछनीय कोशिकाओं से बांधती हैं, जो चुंबकीय रूप से हटा दी जाती हैं, जिससे लक्ष्य कोशिकाओं को मोती से बिना संपर्क किया जाता है। इस बाद की विधि को प्राथमिकता दी जाती है जब लक्ष्य कोशिकाएं दुर्लभ, नाजुक होती हैं, या कार्यात्मक अध्ययन के लिए लेबल नहीं होना चाहिए।

चुंबकीय पृथक्करण में कदम

]Sample तैयारी: ऊतक अलगाव, ढाल अपकेंद्रित्र, या एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए लाल रक्त कोशिकाओं के lysis. 30-40 माइक्रोन जाल के माध्यम से निस्पंदन अक्सर clumps को हटाने के लिए किया जाता है।
]] चुंबकीय मोती के साथ ऊष्मायन: सेल निलंबन को बीड-एंटीबॉडी कंज्यूगेट की पूर्व निर्धारित राशि के साथ मिलाया जाता है। ऊष्मायन की स्थिति (समय, तापमान, आंदोलन) को गैर-विशिष्ट आसंजन को कम करते हुए बाध्यकारी को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया गया है।
Magnetic कैप्चर: मिश्रण को एक चुंबकीय क्षेत्र में रखा जाता है (एक स्तंभ, ट्यूब या प्लेट प्रारूप में स्थायी चुंबक का उपयोग करते हुए)। बीड-बाउंड कोशिकाएं चुंबक की ओर माइग्रेट होती हैं, जबकि अपरिवर्तित कोशिकाएं दूर हो जाती हैं।
Wash steps:] बफर के साथ एकाधिक washes (often PBS with 0.5% BSA and 2 mM EDTA) unbound कोशिकाओं और अवशिष्ट मोती को दूषित करने से हटा दें।
Recovery: सकारात्मक चयन के लिए, कैप्चर किए गए कोशिकाओं को चुंबक को हटाकर और गोली को फिर से समाप्त करके अलग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को बाद में assays के लिए चुंबक पर सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है।

चुंबकीय पृथक्करण प्रणाली के प्रकार

कई वाणिज्यिक प्लेटफॉर्म उपलब्ध हैं, प्रत्येक को विभिन्न थ्रूपुट और स्वचालन स्तरों के लिए अनुकूलित किया गया है।

]Column आधारित प्रणालियों (जैसे, Miltenyi Biotec MACS): कोशिकाएं एक मजबूत चुंबकीय क्षेत्र में रखे गए स्टील ऊन स्तंभ के माध्यम से गुजरती हैं। बीड-लेबलेड कोशिकाएं बरकरार रखी जाती हैं, जबकि अनलेबल कोशिकाएं प्रवाहित होती हैं। स्तंभ को धोया जाता है और फिर चुंबक से बंद कर दिया जाता है ताकि सीमा को अलग किया जा सके। यह प्रणाली बड़ी सेल संख्या (10 ^]]9]]]] को संसाधित कर सकती है और उच्च शुद्धता प्राप्त कर सकती है।
ट्यूब आधारित या प्लेट आधारित सिस्टम (जैसे, डायनाबैड्स, स्टेमसेप): मोती के साथ मिश्रित सेल को एक चुंबक के पास ट्यूब या माइक्रोप्लेट में रखा गया है। बीड-बाउंड कोशिकाएं पक्ष या नीचे तक खींची जाती हैं, और सुपरनैटेंट को हटा दिया जाता है। यह दृष्टिकोण सरल और तेज़ है लेकिन इसमें कम थ्रूपुट हो सकता है।
माइक्रोफ्लोडिक डिवाइस: इमर्जिंग टेक्नोलॉजीज एकीकृत मैग्नेट या चुंबकीय क्षेत्र ढाल के साथ माइक्रोचैनलों का उपयोग करके कोशिकाओं को एक एकल सेल स्तर पर अलग करने के लिए करती हैं। ये दुर्लभ सेल अलगाव के लिए आशाजनक हैं लेकिन अभी तक मुख्यधारा नहीं हैं।

पारंपरिक तरीकों से अधिक लाभ

चुंबकीय मनका अलगाव प्रवाह साइटोमेट्री आधारित छँटाई (FACS) या घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र की तुलना में कई फायदे प्रदान करता है:

Speed: विशिष्ट प्रोटोकॉल 30-60 मिनट लेते हैं, जो FACS के लिए घंटों की तुलना में, एक साथ कई नमूनों को संसाधित करने के लिए उपयुक्त बनाते हैं।
]Scalability: 10 ^]5] से 10 ¹⁰]] प्रणाली के आधार पर कोशिकाओं को एक रन में संसाधित किया जा सकता है। नैदानिक पैमाने के सेल उपचार के लिए यह महत्वपूर्ण है।
]Simplicity: कोई महंगा इंस्ट्रूमेंटेशन (केवल एक चुंबक की आवश्यकता) और न्यूनतम ऑपरेटर प्रशिक्षण। प्रोटोकॉल सीधा और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है।
Gentle हैंडलिंग: Shear बलों कम हैं, और कोशिकाओं को उच्च दबाव या बिजली के क्षेत्रों के अधीन नहीं किया जाता है। व्यवहार्यता आम तौर पर 90% से अधिक है।
Versatility: प्राथमिक कोशिकाओं, स्टेम सेल, बैक्टीरिया, और यहां तक कि उपकोशिका organelles सहित कई सेल प्रकारों के लिए लागू। बीड्स को प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड कैप्चर के लिए कार्यात्मक भी बनाया जा सकता है।

विचार और सीमाएं

इसके लाभों के बावजूद, चुंबकीय मनका अलगाव में गुफाएं हैं। मनका हटाने को उन अनुप्रयोगों के लिए विचार किया जाना चाहिए जहां मोती हस्तक्षेप कर सकते हैं, जैसे कार्यात्मक assays या प्रत्यारोपण। कुछ सिस्टम एंजाइमेटिक या यांत्रिक मनका detachment की अनुमति देते हैं, लेकिन यह कोशिका व्यवहार्यता या मार्कर अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, सेल सतह एंटीजन के लिए मोती के बंधन सिग्नलिंग या सक्रियण को ट्रिगर कर सकते हैं, सेल व्यवहार को बदल सकते हैं। नकारात्मक चयन के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री के साथ कमी की पुष्टि की जानी चाहिए। अंत में, बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए लागत महत्वपूर्ण हो सकती है, हालांकि कई प्रोटोकॉल सीमित चक्रों के लिए मोती का पुन: उपयोग करने की अनुमति देते हैं।

अनुसंधान और चिकित्सा में अनुप्रयोग

चुंबकीय सेल अलगाव का उपयोग बड़े पैमाने पर बायोमेडिसिन में किया जाता है। प्रमुख क्षेत्रों में शामिल हैं:

प्रतिरक्षाविज्ञान

टी सेल सबसेट (जैसे, CD4+, CD8+), बी कोशिकाएं, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाएं, डेंड्रिक्टिक कोशिकाएं, और कार्यात्मक assays, साइटोकिन प्रोफाइलिंग, या अपनाने वाले हस्तांतरण प्रयोगों के लिए मोनोसाइट्स का अलगाव। सक्रियण से बचने के लिए नकारात्मक चयन को बिना स्पर्श किए टी कोशिकाओं के लिए पसंद किया जाता है।

कैंसर अनुसंधान

एंटी-एपीसीएएम या एंटी-एचईआर 2 मोती का उपयोग करके रक्त से ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) को परिसंचारी करने का संवर्धन। यह ट्यूमर प्रगति और उपचार प्रतिक्रिया की गैर-इनवेसिव निगरानी की अनुमति देता है। इसी तरह, कैंसर स्टेम कोशिकाओं को सीडी44 / सीडी 24 अभिव्यक्ति के आधार पर समृद्ध किया जा सकता है।

स्टेम सेल बायोलॉजी

हड्डी मज्जा से हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (CD34+) का सकारात्मक चयन या प्रत्यारोपण के लिए परिधीय रक्त को जुटाया जाता है। मेसेनचाइमल स्टेम सेल (MSC) अक्सर अवांछित कोशिकाओं को हटाने के लिए नकारात्मक चयन से अलग हो जाते हैं।

पुनर्योजी चिकित्सा

सेल थेरेपी विनिर्माण, संलयन से पहले चिकित्सीय सेल आबादी को शुद्ध करने के लिए चुंबकीय अलगाव पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, आनुवंशिक संशोधन से पहले CAR-T थेरेपी के लिए T कोशिकाएं चुंबकीय मोती से अलग हो जाती हैं।

सूक्ष्म जीवविज्ञान

बैक्टीरियल या वायरल एंटीजनों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेपित चुंबकीय मोती जटिल नमूनों से रोगजनकों का पता लगाने या अलगाव की अनुमति देते हैं। इसका उपयोग खाद्य सुरक्षा और नैदानिक निदान में किया जाता है।

भविष्य निर्देशन और नवाचार

हाल के घटनाक्रम में शामिल हैं:

]Multiparametric अलगाव: एकाधिक आबादी को अलग-अलग आकार / चुंबकीय गुणों के साथ कई बीड प्रकारों का उपयोग करना।
ऑटोमेशन और माइक्रोफ्लिडिक्स: उच्च-थ्रूपुट, कम मात्रा नमूना प्रसंस्करण के लिए तरल-handling रोबोट के साथ एकीकरण।
]Improved bead डिजाइन: बाइओडिग्रेड्डबल मोती जो आंतरिककरण के बाद नीचा हो, या नैनोस्केल मोती जिसका उपयोग इंट्रासेल्युलर डिलीवरी के लिए किया जा सकता है।
अन्य प्रौद्योगिकियों के साथ संयोजन: अति-शुद्ध आबादी के लिए FACS के बाद चुंबकीय मोती के साथ पूर्व-संवर्धन।

चूंकि चुंबकीय मनका प्रौद्योगिकी परिपक्व होती है, यह व्यक्तिगत चिकित्सा और सेल आधारित चिकित्सा के लिए भी अभिन्न होने की संभावना है।

निष्कर्ष

चुंबकीय बीड सेल अलगाव ने जटिल मिश्रण से विशिष्ट सेल प्रकारों को अलग करने और शुद्ध करने के तरीके को बदल दिया है। गति, सादगी और कोमल हैंडलिंग के संयोजन के साथ, यह बुनियादी अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों दोनों में एक अनिवार्य उपकरण है। सिद्धांतों को समझना, उचित प्रणाली का चयन करना और प्रोटोकॉल को अनुकूलित करना उच्च शुद्धता, व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। चल रहे विकास भी अधिक कार्यक्षमता और एकीकरण का वादा करते हैं, यह सुनिश्चित करते हुए कि चुंबकीय बीड अलगाव वर्षों तक एक कोनेस्टोन तकनीक बना रहा है।

आगे पढ़ने के लिए: Miltenyi एट अल. - चुंबकीय सेल अलगाव (Nature Biotechnology) ], ]]को सेल अलगाव में चुंबकीय मोती का अवलोकन (Immunology Methods के जर्नल) , ] चुंबकीय माला पर सिग्मा-Aldrich तकनीकी गाइड ]] ]]]