現代の遺伝的研究は、精密遺伝子編集ツールの開発によって駆動される変革の時代に入りました。 先駆的な技術の中で、TALENs(Transcription Activator-Like Effector Nucleases)とZFN(Zinc Finger Nucleases)は、CRISPR革命前の長期的にターゲットを絞ったDNA修正を有効にした基礎的なプラットフォームとして際立っています。 これらの技術により、科学者は、科学者が定義されたゲノムの場所に二重線路の休憩を導入し、チップを移動し、遺伝子の根本的な修復や遺伝子検査を継承することを可能にします。

TALENとZFNのメカニズムを理解する

亜鉛指の核種:モジュラー DNA の認識

ZFNは、1990年代半ばに最初に記述されたプログラム可能な核種である。各ZFNは、亜鉛フィンガータンパク質とDNA-cleavageドメインから組み立てられたDNA結合ドメインを構成し、]FokI[]]から得られるDNA-cleavageドメインをそれぞれ構成しています。個々の亜鉛フィンガーモジュールは、通常、三核種配列を認識しています。タンデムの複数の指をリンクすることにより、研究者は、ターゲットを9Fots[FLT]から9Fotarage[F]に分けて、ターゲットを切断する必要があります。

亜鉛指配列の設計とアセンブリは、コンテキストに依存する親和性のために技術的に困難であることができます。亜鉛指の認識は、隣接する指によって影響を受けることができます。それにもかかわらず、オープン(Oligomerized Pool Engineering)やコンテキスト依存アセンブリなどの方法は、予測性が向上しました。 ZFNsは、ノックアウト細胞ラインを作成したり、トランスジェンシー動物モデルを生成したり、早期臨床試験で正しい病気原因変異を生成したりするために使用してきました。

トランスクリプションアクティベータライク エフェクト ヌークラーゼ: シングル ノークレオチド スペシャリティ

TALENsは、2009年から2010年にかけて、よりシンプルなデザインルールの代替として登場しました。DNA結合ドメインは、トランスクリプションアクターのような効果要因(TALE)、植物病原体()によって分泌されるタンパク質から来ています。ガントモナス[]。各TALEモジュールは、まさに1つの核種を認識し、アミノ酸残留物は2つの多変種で、繰り返しの変数の利尿(RV)として知られています。これらは、これらは、一般的には、NARNARNの定義されたDNAを、RV(RV)、これらは、これらを、最も多く、これらは、RVARNARENS(RV)、または、これらは、または、NARENは、またはNARENは、またはNARENは、またはNARENは、またはN)の特定のモジュールの比較する。

TALENsは、 ]FokI[]]]のクトラバージドメインを使用して、切断のためのペアリングされた結合を必要とします。 TALEの繰り返し配列のアセンブリは、ゴールデンゲートクローニングまたはソリッドフェーズ合成を使用して達成することができます。 TALENsは、一般的に、ZFNsよりも高い特異性を発揮し、細胞内の毒性が低下するが、その大型(モノマーあたり3kb)は、ウイルスベクトルの配信のための制限を得ることができます。 いえ、彼らは成功した、ウサギ、遺伝子検査および遺伝子検査、ヒトの検査、いくつかの遺伝子検査を、使用しました。

歴史発展とマイルストーン

エンジニアの核種は1980年代後半に亜鉛フィンガータンパク質の発見から始まりました。 1996年、チャンドラセガランと同僚は3-zinc-fingerドメインをFokIに溶かし、最初のZFNを作成します。 このブレークスルーは、]Drosophilaに、ヒト細胞の細胞に注入された[FLT:FLT:0]をF]、その後、ZF[FLT:]F]をF]F[F]F]F]F]F[F]F]F]F]F]をF]F[F]F]F]F]F[F]F]F]F]F[F]F]F]F[F]F]F]F]F]F]F[F]F]F[F]F[F]F]F]F[F]F]F[F[F]F]F]F]F[F[F[F]F]F[F]F]F[F]F]F[F]F

TALENは2007年にTALEタンパク質の構造的利用が急速に発展しました。3年以内に、遺伝子の編集がイースト、植物、ヒト細胞で機能するTALENsが報告されています。その単純性は、遺伝子の編集を採用し、発見の波をスパークさせる学術的ラボの障壁を下げました。2012年までに、TALENsは、疾患モデル化とXenotransplantation Researchのための最初の遺伝子編集豚を作成するために使用されました。 [FLT] [FREF] とKimpref] [F] と [F] [Fen] の両者と [F] [F] キム [F] [F] [F] [F] と [F] [F] [F] [F] [F] [F] と [Fen] と [Fen] の2] の比較 [F] の比較: [F] の比較: [F] と [F] [F] [F] [F] [F] と [Fen] と [Fen] の2 [Fen] の比較: [F] の2

現代研究の応用

医療研究と遺伝子治療

ZFNとTALENは、マウスの病変に対する遺伝子治療を高度化しています。 病気細胞疾患およびベータ・サール・チェック貧血では、ZFNは[BCL11Aを標的とするBCLのエリスロワレンサーは胎児のヘモグロビン発現を活性化させます。 相1/2の臨床試験(NCT032856)は、FFSNを使用して、血液幹細胞を分解する細胞を活性化させるための免疫組織の働きを抑制しました。 [FALT] 免疫組織は、および免疫組織の細胞の細胞を活性化させるための働きを、免疫組織にするために、組織する組織の細胞を組織の組織の組織の組織に変えました。 [F]

農業バイオテクノロジー

作物改善では、TALENとZFNは、除草剤耐性および病害防止品種を作成するために使用されてきました。最初の市場はTALEN-edited作物 - 改善された油プロファイルを持つ大豆 - は、Calyxtによって開発され、2019でリリースされました。 ZFNsは、穀物サイズの負の規制をノックアウトすることにより、米の収量を増加させるために適用されています。これらの核酵素の高特異性は、非強化されたゲノミネーションを減らし、それは[FALT]の適応性分析と[F]のGe[F]の分析]を[F]]します。

機能的ゲノムとモデルの組織

両プラットフォームは、胚性幹細胞が利用できなくなった種で系統的な遺伝子ノックアウト研究を有効にしました。ゼブラフィッシュでは、TALENsは、開発と疾患における遺伝子機能の明らかに、単一のコンソーシアムの努力で>200標的ミュートを作成するために使用されました。ラットでは、ZFNsは腫瘍抑制剤を使用して、癌モデルを作成する。癌モデルを作成するには、免疫疾患を抽出するシングルオリジン疾患を使用して正確なポイントの変異を生成する能力も持っています。

強度と限界は、CRISPR-Cas9 と比較して

CRISPR-Cas9(2012)の出現により、よりシンプルな設計、多重化機能、そしてより高性能な機能を提供しており、幅広い採用につながります。しかしながら、TALENsとZFNsは、ユニークな利点を保持しています。そのタンパク質ベースのDNA認識は、RNAガイドに依存せず、RNA-mediated off-target効果のリスクを排除します。さらに、ZFNとTALENsは、繰り返しまたはGCF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-COF-CO

主要な制限は、ZFN または TALEN を各ターゲットに設計するために必要なコストと労力です。CRISPR は 20 ビットのガイドシーケンスを再設計する必要がありますが、ZFN と TALEN の合成は、タンパク質ドメインアセンブリと検証を必要とします。オフターゲットの乱数も懸念しています。亜鉛フィンガーアレイは、誤ったマッチを許容し、TALEN は部分的なターゲットサイトで切断できます。ガイドやガイドのような方法を使用して包括的なオフターゲットプロファイリングは、CFELT または CLTLT の3 の分析は、これらの手順は、CALT と の[F] の[F] の[F] の[F] と [F] の3] の[F] の[F] の[F] の[F] は、 [F] と [F] の[F] の[F] の[F] の[F] の[F] の[F] の[F] の[F] の[F] の[F] の[F]

今後の方向性・継続的改善

現在の研究では、生産コストを削減しながら、TALENsとZFNの効率性と安全性を高めることを目指しています。 タンパク質工学の進歩により、ZFNは熱安定性を高め、細胞毒性を低下させました。 構造ガイドの再設計]FokI[]の変形(ELD-KKKRやSharkeyなど)は、ダイマライゼーションの特異性と触媒活性を高めています。 TALENsの配列では、RVD-D-FLT-FLT-F-F-FLT-R-R-R-R-R-R-R-R-R-R-R-R-R-R-R-R-R-R-R-RV-R-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-D-

デリバリーは、生体内アプリケーション用のボトルネックを残します。 脂質ナノ粒子とアデノ-アソシエーションウイルスベクトルは、肝細胞および肝細胞のために精製されています。 ZFN/TALENタンパク質(DNAよりもむしろ)の過渡的配送は、長期の核種発現とオフターゲティングイベントを削減します。 農業では、TALENは、外出先のDNAを含まない自然アレルを侵入するシゲニック作物を開発するために使用されています。 これらの規制当局は、これらの承認を事前に確認し、これらの認定された安全ツールを事前に確認することができます。

最後に、TALENs または ZFN とベース編集またはプライマリ編集の組み合わせ — NICKses に依存する技術は、二重鎖破壊よりもむしろ、そのユーティリティを拡張します。例えば、Zn ‐finger‐リンクされたシチジン・デアミナミゼは、二重鎖破壊のないターゲットベースの変換を実行できます。 ZFN ベースの CCR[FLT][FLT][FLT][FLT][FLT][FLT][FLT]]:[FLT]:[FLT]:[FLT]:[F]:[F]:[F]]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]:[F]

結論として、TALENsとZFNは遺伝子研究ツールボックスに不可欠です。その特徴は、DNAのDNA認識、高い特異性、そして、安全性を確立するものです。特にRNA-ベースのツールが適さないとき、特定のアプリケーションにとっては、その可能性を秘めています。この分野は、精密医学と持続可能な農業に向けて動き、これらの先駆的な核は、人間の健康と食品の安全性を向上させる発見を触媒し続けるでしょう。