細胞の感覚の生物学

長期細胞培養は、薬物発見、毒性学、再生医療、および基本的な生物学における無数の実験の背骨を形成します。しかし、すべての連続線は、最終的には基本的な障壁に直面しています。細胞の静けさ。発症は、さまざまな本質的および内因性のストレスに反応して起こる細胞増殖の安定した逮捕です。逆にすることができる、そのキエッセンスとは異なり、センセント細胞は代謝的に作用し、恒久的な状態を低下させ、遺伝子検査や遺伝子検査を阻害する。この遺伝子は、遺伝子検査および遺伝子検査を阻害する遺伝子検査を阻害する。

主トリガーとセネシスのパスウェイ

テロメアの短縮と再編的セネス

DNAのレプリケーションの各ラウンドは、テロメレスを短縮します。クロモソームの端にある保護キャップ。テロメレスが極めて短くなれば、DNAのダメージ応答(DDR)は、パー53とp21を活性化し、恒久的な細胞のサイクルの防止につながります。このレプリカ的なセインセンスは、最もヒトの細胞にとって自然な限界であり、十分なtelomerase活性を欠きます。文化では、テロメアエションは、潜水条件下で加速し、第一次寿命を延ばすための予防策を加速します。

オンコジェネ-誘発性沈黙(OIS)

RAS]や]BRAFなどの発熱をp16]INK4a[]]/RB経路を介して発熱をトリガーできます。文化では、発がん(例えば、自発的な突然変異を介して)の不慮の活性化は、腫瘍が増加する可能性があるが、OISは、腫瘍が、高機能が、腫瘍が、組織が、組織的には、組織が、組織が、組織が組織的には、組織が、組織的には、組織が、組織的には、組織が組織的には、組織が組織的には組織化されていない。

酸化ストレスとDNAダメージ

正常な新陳代謝または文化の状態(例えば、高い酸素の張力、軽い露出)からの反応酸素の種(ROS)はDNAの損害、蛋白質の酸化および脂質のパーオキシドを引き起こします。持続的な酸化の損傷はDDRおよびp53を、運転します早期の精巣を活動化させます。大気酸素(~20%)の標準的なインキュベーターは生理学的なレベル(1–5%)より高い酸化の圧力を、加速する多くの細胞のタイプで加速します。

エピジェネティック・デレギュレーション

ヒストンの修正と培養年齢とDNAメチル化パターンが変化します。ヘテロクロマチンのマークの損失、開発遺伝子の再抽出、および変更されたクロマチン再生成は、テルメアの長さの独立して、静止経路を活性化することができます。エピジェネティック不安定性は時間をかけて蓄積し、不十分な培養媒体によって悪化します。

長期文化におけるセンセスセンスを防止する戦略

1. テロメラーゼの活発化およびhTERTの表現

レプリカの静止を避けるための最も直接的な方法は、テロメラーゼの活動を回復することです。 主な線維芽細胞、上皮細胞、および中性幹細胞を含む多くの細胞タイプは、テルメラーゼ(hTERT)の触媒作用のサブユニットの構成的表現によって不均質にすることができます。このアプローチは、他の培養条件が最適化されている、何百もの人口の倍以上のtelomere長さを維持します。hterT式は、単に変形性を及ぼすことはありません。しかし、それは、他の細胞が、その場合、その効果が期待されるように、他の細胞を変化させることはありません。

2. 文化条件の最適化

あらゆる変数の環境は、静電の発症に影響を及ぼします。次の調節は、有効な証明されています。

  • [低酸素張力。] 2〜5% O2(ほとんどの組織のためのノモキシア)で細胞を治癒し、ROSの生産を削減し、低酸素化因子を安定させ、そして、沈黙を遅らせます。 多くの幹細胞と第一線は、有意に低酸素条件下で自分の寿命を延ばします。
  • [抗酸化剤の補充。[]] N-acetylcysteine、ビタミンE、またはグルタチオンプレカサルなどの化合物を追加して、ROSをスカベンジし、テロメラーを保護することができます。しかし、過度に高用量は毒性があります。 滴定は不可欠です。
  • []高品質メディアと血清。[は、最適化されたグルコース、グルタミン、およびピルビン酸レベルを備えた、新鮮な調製されたエンドトキシンフリーメディアの使用は、代謝ストレスを軽減します。 胎児牛皮(FBS)バッチの変動は、精練に影響を与えます。 定義された血清フリー製剤または低FBSサプリメントを使用して、再現性を向上させることができます。
  • pHとオソマリティコントロール。[ 強気なビカーンバッファリングによる頻繁な中的変化(CO2の外にHEPESを使用) は、酸性化と吸湿性ショックを防止します。
  • []表面コーティングおよび細胞外マトリックス。[[]) 細胞が、細胞が、それらの自然環境を模倣する基質で成長すると、沈黙は遅れます。コラーゲン、ラミン、または線維膜コーティング。例えば、細胞化マトリックスで培養される転移性幹細胞は、プラスチックよりも高い増殖能力を維持します。

長期経過における文化条件の最適化に関する詳細なプロトコルについては、 []]の]のCurrent Protocols in Cell Biologyのガイドライン]]は、実用的なベンチマークを提供します。

3. テレマーナーゼを越えて遺伝子改変

hTERTは最も一般的な不均質化ツールですが、他の遺伝子介入は補完的な経路を介して精巣に取り組むことができます。

  • 抗静止遺伝子の過剰発現。[ ]]BMI1 (B-cell固有のMoloney murine loukemia virus 統合サイト 1) ]]]]]/[]]ARF[FLT]] [FLT]: [FLT: [FLT]: [FLT] [FLT]: [FLT] と [FLT] 両方を[FLT] 再発散水] [F] [F] [FLT: [FLT: [FLT: [FLT: [F] [FLT: [FLT: [FLT: [FLT] ] ] と [FLT: [FLT: [FLT: [FLT: [FLT: [F] ] ] と [F] と [FLT: [F] ] ] ] ] [FLT: [F] ] と [F
  • 静止血 - 測定遺伝子のKnockdown。[]] 沈黙 ]p21 または ]]p16[]]]] shRNA または CRISPR-i を使用して細胞を逮捕することができます。このアプローチは、変換のリスクを高める可能性があるため、慎重に使用する必要があります。
  • [CRISPR/Cas9-based アプローチ。[]]] テロマーゼのプロモーターの精密な編集や、telomere-associated 損傷経路の修復ができるようになりました。例えば、[ATM]]を破壊すると、ショートテルマーレにもかかわらず、DNA損傷チェックポイントを抑制し、分割が継続して、それは、ほとんどの戦略を組み合わせて、最も安定した戦略を中断します。

4. 小さい分子のセノリティックスおよびsenescenceの逆転

静止を防ぐ代わりに、いくつかの化合物は、選択的にセンセント細胞を排除するか、SASPをブロックすることができます。これらは、予防された細胞をクリアするが、成長を回復しないため、増殖文化を維持するためにあまり有用ではありません。しかし、事前調整と組み合わせると、それらは全体的な文化の健康を向上させることができます。

  • [ダサチニブ+ケルセチン。[]]]この組み合わせは、熱心な細胞の負担を軽減し、そして、その中、それはいくつかの主要な文化に膀胱毒性です。
  • [ラパマイシン。]]]]は、複数のセルタイプで静けさを遅らせ、SASPを削減し、Autophagyを強化することによって。 それは、telomereの短縮を直接防止するが、他の静止のホールマークのオンセットを延期しません。
  • []Metformin.]は、アンチエイジング効果で知られ、MeetforminはミトコンドリアROSを削減し、AMPKを活性化し、それによって、中性幹細胞および内皮のプロゲニタの静止を遅らせる。
  • レスベラトロールとニコチンアミドリボシド。[]これらのNAD +プレカーサートは、ヘテロクロマチンと延食を維持することができます。

センソラエピュース化合物の包括的な概要は、 ]this ]Cell]]]]にセネスステンゲ薬の検討。

長期文化の実践的な日常的管理

最適な条件と遺伝子ツールでも、日〜日間の処理は、湾で維持されるかどうかを決定します。次の運用ガイドラインは、堅牢な文化を維持するのに役立ちます。

  • [ 通路番号を省略します。[]] 主線、クライオペレヴェ初期通路、必要に応じてのみ拡張します。 通路追跡システム(累積人口倍数、単なる通過数)を使用して、寿命を監視します。
  • 過剰な告白を空にしない[ 混同時の阻害と栄養素の枯渇と排液および鎮静を誘発する。 細胞が70〜80%の溶着に達すると、培養下がる。
  • [] 優しい離脱方法を使用します。[ トリプシン/EDTAの暴露は最小限にする必要があります。 粘度セルのaccutaseまたは非酵素の分裂緩衝を使用して検討してください。 延伸は、表面受容体を損傷し、ストレス応答をトリガーします。
  • [モニターストレスマーカー。[ 静止血症のためのルーチン染色- β- ガルアコトイダーゼ(SA-β-gal)または ]p21[]と[]]])は、早期の兆候を検出することができます。広範囲にわたる逮捕が発生する前に、是正措置を実施します。
  • [ 保存のベストプラクティス。[ 高確率凍結メディア(例えば、10%DMSO + 90% FBS)、制御レート凍結またはイソプロパノール容器、液体窒素蒸気相で保存します。DMSO毒性のない可燃性解凍は重要です。
  • バッチテスト血清とメディア。[]新しいロットにコミットする前に、3〜5の通路で成長曲線を実行して、倍増時間と静電率を比較します。

今後の方向性:次世代のアプローチ

フィールドは従来の2D単層文化を超えて移動しています。 オルガノイド、スプヒーロード、およびバイオリアクター文化などの3次元システムでは、多くの場合、粘膜アーキテクチャと栄養素の勾配でより微動するので、遅延の沈黙を展示しています。 マイクロフラウディドの灌流装置は、廃棄物を除去し、ストレスを軽減することができます。 さらに、誘発性幹細胞(iPSC)は、無制限の自己更新能力を持ち、異なる細胞を抽出し、必要に応じて細胞を合成し、細胞を結合するなどの副作用を促進します。

もう一つのエキサイティングな方向は、部分的に再プログラムセルにヤマナカ因子(Oct4、SOX2、Klf4、c-Myc)の過渡式の使用であり、アイデンティティを消去することなく、上世代をリセットします。 線維芽細胞の研究は、これらの要因の簡略化、精巣マーカーを減少させ、レプリカ寿命を延ばすことを示しています。 この「エピジェネティックな若返り」アプローチは、開発中でありながら、非遺伝子的感覚テロメトラライゼーションに代わる代替手段を提供します。

コンテンツ

長期細胞培養における鎮静を防ぐには、テロメア生物学、酸化ストレス、文化環境、遺伝的安定性を重視する層別戦略が必要です。単一のソリューションは、ユニバーサルに機能しません。最も優れた結果は、テロメラーゼの活性化(hTERTによる)を組み合わせることから、最適化された低酸素条件、高品質のメディア、穏やかな処理、および定期的なモニタリングを伴います。研究者は、機能的なアッセイ、バイオ人口、またはそれらの効果を分析するために、これらの科学的効果を検証するかどうか、細胞のエンドの使用を検討する必要があります。これらの研究は、科学的効果を分析し、科学的効果を生み出すことができることを意味し、科学的効果を生体質的な効果を生み出します。