장기적인 세포 문화에서 Senescence 예방을 위한 전략

세포질의 생물학

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연구원과 연구원의 통로

Telomere 단축 및 복제 Senescence

telomeres는 telomeres의 각 둥근 telomeres-chromosome 끝에 방어적인 모자를 복제합니다. telomeres가 긴 때, DNA 손상 응답 (DDR)는 p53와 p21를, 영원한 세포 주기 체포에 지도합니다 활성화합니다. 이 복제적인 senescence는 충분한 telomerase 활동을 부족한 대부분의 인간적인 somatic 세포를 위한 자연적인 한계입니다. 문화에서는, telomere erosion는 subimal 조건의 밑에 가속하고, telomere telomere 관리는 1 차적인 수명을 위한 telomere 구속을 확장합니다.

Oncogene-Induced Senescence (OIS)의 연구

RAS 또는 BRAF]은 p16^INK4a/RB 통로를 통해 senescence를 유발할 수 있습니다. 문화에서, oncogenes의 실수 활성화 (예를 들어, spontaneous mutations를 통해)는 O-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-th-th-th-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-th-th-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-des-

산화 스트레스와 DNA 손상

정상적인 물질 대사 또는 문화 조건 (예를들면, 높은 산소 긴장, 가벼운 노출)에서 민감하는 산소 종 (ROS)는 DNA 병변, 단백질 산화 및 지질 peroxidation를 일으키는 원인이 됩니다. 지속적인 산화 손상은 DDR와 p53를 활성화하고, 조기 senescence를 몰기. 대기 산소 (~20%)에 표준 incubators는 생리적인 수준 (1-5%) 보다는 더 높은 산화 응력을, 많은 세포 유형에 있는 가속 senescence 부과합니다.

Epigenetic 통제

스톤 수정 및 DNA 메틸화 패턴은 문화 시대와 변화합니다. 이 크로마틴 마크의 손실, 개발 유전자의 재 압축, 그리고 변경된 크롬 레닌 재현은 telomere 길이의 senescence 통로를 독립적으로 활성화 할 수 있습니다. 시간 동안 Epigenetic 불안정한 축적 및 inadequate 문화 매체에 의해 배전됩니다.

장기 문화에 대한 Senescence 방지 전략

1. Telomerase 활성화와 hTERT Expression

텔로미아제 활동은 텔로미아제 활동을 복원하는 가장 직접적인 방법입니다. 텔로미아제의 주요 섬유 폭발, 서사적 세포 및 mesenchymal 줄기 세포를 포함한 많은 세포 유형은 telomerase (hTERT)의 촉매 하위 단위의 구성표현식으로 immortalized 수 있습니다. 이 접근법은 수백 개의 인구 투수에 걸쳐 telomere 길이를 유지하며 다른 문화 조건을 최적화합니다. hTERT expression은 telomerase (HTERT)의 변형을 유발하지 않습니다. [F]는 다음과 같은 기능을 포함합니다. [F]

2. 최적화 문화 조건

vitro 환경의 각 모수는 senescence onset에 영향을 미칩니다. 뒤에 오는 조정은 효과적인 입증했습니다:

낮은 산소 긴장. 2-5% O2 (최대 조직을 위한 normoxia)에 세포를 경작하는 것은 비강산성 성분을 안정시키는 비강산을 감소시키고, senescence를 연기합니다. 많은 줄기 세포 및 1 차적인 선은 hypoxic 조건 하에서 그들의 수명을 두드러지게 합니다.
항산화제 보충. N-acetylcysteine, 비타민 E, 또는 glutathione 전구체와 같은 화합물을 추가하는 것은 ROS를 사기 위하여 흩어지기 수 있고 telomeres를 보호합니다. 그러나, 지나치게 높은 복용량은 유독할 수 있습니다; titration는 근본적입니다.
고품질의 미디어와 혈청. 신선한 준비의 사용, 최적화된 포도당, 글루타민 및 피류 수준이 대사 스트레스를 감소 시키는 endotoxin ‐free 미디어. Fetal bovine serum (FBS) 배치 변형은 senescence에 영향을 미칩니다; 정의된 혈청 자유로운 정립 또는 낮은 ‐ FBS 보충을 사용하여 재현성을 향상시킬 수 있습니다.
pH 및 osmolality control. 단단한 탄산염 버퍼링과 함께 정밀한 중간 변경 (CO2 incubators 외부에 HEPES 사용) 탈취 및 osmotic 충격 방지.
표면 코팅 및 셀룰러 매트릭스. 세포가 기본 환경-콜라겐, 라미네인, 또는 섬유 섬유 섬유 코팅을 모방하는 기판에 재배 될 때 세이네이션이 지연됩니다. 예를 들어, mesenchymal 줄기 세포는 탈세포화 된 매트릭스에 대한 더 높은 확률을 유지 플라스틱에.

장기 통행을 위한 문화 조건을 최적화하는 상세한 프로토콜을 위해, ] Cell Biology] 가이드라인]]는 실제 벤치 마크를 제공합니다.

3. Telomerase를 넘어서 유전 Modification

hTERT는 가장 일반적인 immortalization 도구이지만, 다른 유전 개입은 보완적인 pathways를 통해 촉각 senescence를 할 수 있습니다.

]항체의 과외압.] BMI1](B‐cell‐specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) ]INK4a]/ARF]]]]]]에 의한 항원화성분은 의 혈소화에 의해 더 많은 수 있다.
]눈에 얽매이지 않는 유전자의 흉내.] Silencing p21 또는 p16) 는 shRNA 또는 CRISPR‐i를 사용하여 세포를 방출할 수 있습니다. 이 접근법은 변화의 위험을 증가시킬 수 있기 때문에 신중하게 사용되어야 합니다.
CRISPR/Cas9 기반 접근법. telomerase Promotrs 또는 telomere-associated damage pathways의 수리를 수정하는 것은 이제 무관합니다. 예를 들어, ]ATM]] kinase는 DNA 손상 검문소를 차단할 수 있으며, telomeres-tomics-tomics-tomics-val-tomics-val-tomics-val-tomics-val-tomics-val-val-tomics-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val-val

4. 작은 Molecule Senolytics 및 Senescence 반전

senescence를 방지하는 대신, 몇몇 화합물은 선택적으로 형광성 세포를 삭제하거나 SASP를 막을 수 있습니다. 이들은 그들이 말한 세포를 막기 때문에 proliferative 문화를 유지하고 그러나 성장을 회복하지 않기 때문에 더 적은 유용합니다. 그러나, 미리 조절과 결합될 때, 그들은 전반적인 문화 건강을 개량할지도 모릅니다:

Dasatinib + quercetin. 이 조합은 비보와 비포에 있는 형광성 세포 부담을 감소시키고, 그러나 약간 1 차 문화에 세포 독성입니다.
Rapamycin. , 여러 셀 유형의 라파미신 지연 senescence, SASP를 감소시키고, autophagy를 강화. 그것은 바로 telomere 단축을 방지하지 않고 다른 senescence 복도의 onset을 연기하지 않습니다.
Metformin. 그것의 노화 방지 효력을 위해 알립니다, metformin는 mitochondrial ROS를 감소시키고 AMPK를 활성화합니다, mesenchymal 줄기 세포 및 내구적인 progenitors에 있는 senescence.
Resveratrol 및 nicotinamide riboside.] 이 NAD+ 선구자는 이산화 크롬틴과 연기를 유지할 수 있는 사이로틴 활동을 밀어줍니다.

senotherapeutic 화합물의 포괄적인 개요는 ]이 Cell] senescence-targeting 약의 검토].

Long-Term 문화의 실제 일일 관리

최적화된 조건과 유전 도구와 함께, 낮에 ‐ 일 처리는 senescence가 만에 보관된다는 것을 결정합니다. 다음 운영 지침은 강력한 문화를 유지하도록 도와줍니다.

Limit pass number. 1차 선, 초침구 및 필요에 따라 확장. 구절 트랙 시스템 사용 (구근 인구 도풀, 그냥 통행 번호) 수명을 모니터링.
Avoid over-confluence. confluence에 대한 접촉 금지 및 영양분은 쿼티와 senescence를 유도합니다. 세포가 70-80%의 자신감을 도달할 때, 저쪽에.
] 부드러운 분리 방법을 사용합니다. Trypsin/EDTA 노출은 최소한이어야 합니다. accutase 또는 비 효소 분리 완충기를 사용하여 과민한 세포를 위해 고려하십시오. 장시간 사용은 표면 수용체를 손상하고 긴장 응답을 방아쇠를 칩니다.
Monitor stress markers. senescence-associated β‐galactosidase (SA‐β‐gal) 또는 qPCR에 대 한 루틴 얼룩 p21] 및 p16] 초기 징후를 감지할 수 있습니다. 넓은 확산 체포 전에 정확한 작업을 구현할 수 있습니다.
Cryopreservation 모범 사례. 고기능 프리징 매체(예: 10% DMSO + 90% FBS), 제어형 냉동 또는 이소프로타놀 용기 및 액체 질소 증기 단계에 저장. DMSO 독성이없는 비유 해치가 중요합니다.
Batch test 혈청과 미디어.] 새로운 복도를 투입하기 전에, 3~5번의 구로를 통해 성장 곡선을 수행하여 도버링 시간과 senescence 불균형을 비교합니다.

미래 지향: 차세대 접근법

이 분야는 전통적인 2D 단층 문화를 넘어 이동하고 있습니다. 조직, 스파이더로이드 및 생물 자원 문화와 같은 3 차원 체계는 수시로 보보 건축과 양분 윤활제에서 더 나은 원자 때문에 senescence를 연기했습니다. Microfluidic perfusion 장치는 폐기물을 제거하고 신선한 매체를 지속적으로 공급할 수 있고, 긴장을 감소시킵니다. 또한, 유도한 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)에는 무제한 각자 재생 수용량이 있고 원한 sophiematic 세포의 senescence를 위해 다른 수 있습니다. iPSCs는 곧 senescence를 위한 연구 및 개발의 연구에 있는 비열한 연구 및 개발의 결과로 사용될지도 모릅니다.

또 다른 흥미로운 방향은 야마나카 요소 (Oct4, Sox2, Klf4, c‐Myc)의 일시적인 표현의 사용으로 부분적으로 재생 세포에, 정체성을 지우지 않고 서진 헌팅턴 시대를 다시 설정. 섬유 폭발 연구는 이러한 요인의 간략한, 순환적 표현은 senescence 감적을 감소시키고 복제 수명을 연장. 이 "epigenetic rejuvenation" 접근은 여전히 개발 중이지만 비 헌팅턴적 대안을 제공합니다.