Moderne genetisk forskning har gått inn i en transformativ æra drevet av utvikling av presisjonsgenredigeringsverktøy. Blant banebrytende teknologier, TALENs (Transkriptiv aktivator-like effektor nucleases) og ZFNs (Zinc Finger Nucleases) skiller seg ut som grunnleggende plattformer som gjorde det mulig å målrettet DNA-modifikasjon lenge før CRISPR revolusjonen. Disse ingeniørene proteiner tillater forskere å introdusere dobbeltstrandbrudd på definerte genomiske steder, å utnytte cellens inneboende reparasjonsveier ⁇ ikke-homologe sluttforbindelser (NHEJ) eller homologi-direktert reparasjon (HDR) ⁇ for å oppnå gen knockout, rettelse eller innsetting. Deres innflytelse strekker seg over medisin, landbruk og grunnleggende biologisk forskning, og de forblir uunnværlige i applikasjoner der høy spesifikkhet eller små målsekvenser er nødvendig.

Forstå mekanismene til TALEN og ZFN

Sink Finger Nukleases: Modulær DNA-gjenkjenning

ZFN var de første mye brukte programmerbare kjerner, først beskrevet i midten av 1990-tallet. Hver ZFN omfatter et DNA-bindende domene som er samlet fra sinkfingerproteiner og et DNA-krevagedomene som er avledet fra FokI] restriksjonsendonuklease. Individuelle sinkfingermoduler gjenkjenner typisk en tre-kreveotidsekvens. Ved å forbinde flere fingre i tandem kan forskere målrette sekvenser fra 9 til 18 basispar. Fordi FokI] må dimerisere seg betydelig for å kutte DNA, er to ZFN-er utformet for å binde motslige tråder av målområdet, plassert slik at deres spaltedomener kommer sammen over et romområde. Dette kravet for heterodimerisering reduserer betydelig å kutte DNA.

Design og montering av sinkfingerarrangementer kan være teknisk utfordrende på grunn av kontekstavhengige avfiniteter ⁇ en sinkfingers gjenkjennelse kan påvirkes av tilstøtende fingre. Likevel har metoder som OPEN (Oligomerized Pool Engineering) og kontekstavhengig montering forbedret forutsigbarhet. ZFNs har blitt brukt til å skape bankout cellelinjer, generere transgene dyremodeller og korrigere sykdomsfremkallende mutasjoner i tidlige kliniske studier.

Transkriptivator-like effektor nukleaser: Single-Nukleotid Spesifikasjon

TALEN-er dukket opp rundt 2009 ⁇ 2010 som et alternativ med enklere designregler. Deres DNA-bindende domene kommer fra transkripsjonsaktivator-lignende effektorer (TALE), proteiner som er utskilt av plantepatogenet Xanthomonas. Hver TALE-modul gjenkjenner nøyaktig én nukleotid, bestemt av to hypervariable aminosyrerester ⁇ kjent som den gjentatte variabel diresid (RVD). De vanligste RVD-nukleotidparasjonene er NI for adenin, HD for cytosin, NG for timin og NN for guanin (eller NK for høyere spesifikkhet). Ved å arrangere disse modulene i rekkefølge, kan en TALEN målrette nesten enhver DNA-sekvens.

Tallene bruker også FokI spaltedomenet og krever sammensatt binding for skjæring. Sammenstillingen av TALE repetisjonsarrangementer kan oppnås ved hjelp av Golden Gate kloning eller solidfasesyntese. TALENer viser generelt høyere spesifikkhet enn ZFN og lavere toksisitet i celler, selv om deres store størrelse (~3 kb per monomer) kan være en begrensning for virale vektorlevering. Likevel har de blitt påført i sebrafisk, rotter, gris og humane cellelinjer, og i flere prekliniske genterapistudier.

Historisk utvikling og milepæler

Reisen av utviklede nukleaser begynte med oppdagelsen av sinkfingerproteiner i slutten av 1980-tallet. I 1996 konsentrerte Chandrasegaran og kolleger et tre-zinc-fingerdomene til FokI, som skapte det første ZFN. Dette gjennombruddet gjorde det mulig å endre målrettet genomredigering i ] og senere i menneskelige celler. I 2005 hadde ZFNs blitt brukt til å endre CCR5 gen til å gi HIV-resistens, et konsept som senere gikk inn i kliniske studier. Sangamo-tetradiinavir (Sangamo-tetradivers) brukte ZFNs til å forstyrre CCR5 i T-celler, demonstrerte sikkerhets- og langtids-kraft.

TALEN-teknologien utviklet seg raskt etter den strukturelle elucering av TALE-proteiner i 2007. Innen tre år rapporterte flere grupper funksjonelle TALENer for genredigering i gjær, planter og menneskelige celler. Deres enkelhet senket barrieren for akademiske laboratorier til å vedta genomredigering, gnistring av en bølge av oppdagelse. I 2012 ble TALEN brukt til å skape de første gen-redigerte grisene for sykdomsmodellering og xenotransplantasjon forskning. omfattende gjennomgang av Kim og Kim (2014) i Naturanmeldelser Genetik] beskriver den parallelle utviklingen av begge teknologiene.

Søknader i moderne forskning

medisinsk forskning og genterapi

ZFNs og Tallens har avansert genterapi for monogene forstyrrelser. I sigdcellesykdom og beta-thalassemi, ZFNs rettet mot BCL11A erytroid enhancement reactivate fostret hemoglobin ekspresjon. En fase 1/2 klinisk studie (NCT03282656) som bruker ZFNs til å redigere hematopoietiske stamceller ex vivo har vist vedvarende hemoglobinforbedring. TALENs har blitt brukt til å korrigere IL2RG] gen i X-bundet alvorlig kombinert immunsvikt (SCID-X1) pasientceller, med korrigerede celler som viser funksjonell rekonstituering i musemodeller. I oncologi har begge nukleosene blitt brukt til å ingeniør chimerisk antigenreseptor (AR) ⁇ T-celler med forbedret utholdenhet og redusert utmattelse.[FLT][FLT][F][F][FLT][F][L][L][L

Landbruksbiologi

I bearbeidelse av avlinger har TALEN og ZFN blitt brukt til å skape herbicid-tolerant og sykdom - motstandsdyktige varianter. De første markedsførte TALEN-redigerte avlinger - en soyabønne med forbedret oljeprofil - ble utviklet av Calyxt og frigitt i 2019. ZFNs har blitt brukt for å øke avkastningen i ris ved å slå ut negative regulatorer av kornstørrelse. Den høye spesifikkheten til disse nukleasene reduserer utilsiktede genomiske endringer, som er fordelaktig for regulatorisk aksept. En detaljert analyse av Joung og Sander (2013) i Natur Bioteknologi]] vurderer anvendelsen av TALEN i plantegenomteknikk.

Funksjonell genomikk og modellorganismer

Begge plattformene har aktivert systematiske gen knockout-studier i arter der embryoniske stamceller var utilgjengelige. I sebrafisk ble TALENer brukt til å skape > 200 målrettede mutanter i en enkelt konsortium innsats, avsløre genfunksjoner i utvikling og sykdom. I rotter forstyrret ZFNs p53 tumorsuppressor for å skape kreftmodeller. Evnen til å generere nøyaktige punktmutasjoner via HDR ved hjelp av enkelt-strandede oligonukleotiddonorer har utvidet repertoaret av knock-i modeller for nevrodegenerative og kardiovaskulære sykdommer. Forskere har også kombinert TALENer med betinget ekspresjonssystemer for å oppnå vev ⁇ spesifikk redigering.

Styrker og begrensninger sammenlignet med CRISPR ⁇ Cas9

Fremveksten av CRISPR ⁇ Cas9 (2012) tilbød enklere design, multipleksing-evne og høyere effektivitet, noe som førte til dens utbredte adopsjon. Men TALEN og ZFNs beholder unike fordeler. Deres proteinbaserte DNA-gjenkjenning er ikke avhengig av en guide RNA, eliminere risikoen for RNA-medierte avmåleffekter. Videre viser ZFNs og TALENs høyere spesifikkhet for sekvenser med repeterende eller GC-rike regioner som utfordrer CRISPR-målretning. Den større størrelsen på disse konstruksjonene (~4 ⁇ 10 kb) kan pakkes inn i adeno-assosierte virus (AAV) vektorer med vanskelighet, men dual-vegorstrategier og mini-TALEN designer blir optimalisert.

En stor begrensning er kostnadene og arbeidskraften som kreves for å utvikle nye ZFN-er eller Talen-er for hvert mål. Mens CRISPR krever kun redesign av en 20-bp guidesekvens, krever ZFN og Talen syntese proteindomeneenhet og validering. Off-mål spalting er også en bekymring; sinkfingerarrangementer kan tolerere feil, og TALENs kan kutte på delvise målsteder. Overflate av ⁇ målprofilering ved hjelp av metoder som Guide-Seq eller CIRCLE-Seq er essensielt for klinisk oversettelse. A 2017 gjennomgang i Trends i Bioteknologi] kontrasterer fidelitet og leveringsprofiler for disse tre kjernenuasene.

Fremtidige retningslinjer og kontinuerlig forbedring

Nåværende forskning har som mål å øke effektiviteten og sikkerheten til Talener og ZFNs mens de reduserer produksjonskostnadene. Fremskritt i proteinteknikk har gitt ZFNs med forbedret termostabilitet og redusert cytotoksicitet. Struktur ⁇ veiledet redesign av FokI varianter (som ELD ⁇ KKR og Sharky) forbedrer dimeriseringsspesifikkhet og katalytisk aktivitet. For Talener, maskin ⁇ læring algoritmer nå forutsier optimale RVD kombinasjoner for utfordrende mål, og høy ⁇ gjennomstrøms gylden gate kloning muliggjør array produksjon på en enkelt dag.

Levering forblir en flaskehals for in vivo anvendelser. Lipid nanopartikler og adeno-assosierte virale vektorer blir raffinert for hematopoietiske stamceller og hepatocytter. Transient levering av ZFN/TALEN proteiner (utenom DNA) reduserer langvarig nukleaseuttrykk og avmålshendelser. I landbruket brukes TALEN til å utvikle cisgeniske avlinger som introgress naturlige alleler uten fremmed DNA. Det regulatoriske landskapet kan favorisere disse pre-CRISPR verktøy på grunn av deres etablerte sikkerhetsrekord og precedens for markedsgodkjenning.

Til slutt kan kombinasjonen av TALEN eller ZFN-er med baseredigering eller primredigering ⁇ teknikker som er avhengig av nickases i stedet for dobbelt ⁇ strandbrudd ⁇ forlenge deres bruk. For eksempel kan en Zn ⁇ finger ⁇ bunden cytidin deaminase utføre målrettet basekonvertering uten dobbelt ⁇ strandbrudd. Den publiserte kliniske studien på ZFN ⁇ basert CCR5] redigering (Tebas et al., 2014, New England Journal of Medicine]] illustrerer det terapeutiske potensialet som fortsetter å drive investeringer i disse klassiske plattformene.

Til slutt forblir TALEN og ZFN-er avgjørende i den genetiske forskningsverktøykassen. Deres unike egenskaper ⁇ modulær DNA-gjenkjenning, høy spesifikkhet og etablert sikkerhet ⁇ gjør dem uerstattelige for visse anvendelser, spesielt når RNA-baserte verktøy er uegnet. Når feltet beveger seg mot presisjonsmedisin og bærekraftig landbruk, vil disse banebrytende nukleasene fortsette å katalysere oppdagelser som forbedrer menneskers helse og matsikkerhet.