Nevoia urgentă de antibiotice noi

Rezistenţa antibiotică este una dintre cele mai presante ameninţări globale de sănătate. Organizaţia Mondială a Sănătăţii (OMS) a avertizat că, fără acţiuni urgente, infecţiile comune şi leziunile minore ar putea deveni din nou mortale [OMS]]. În Statele Unite, în fiecare an, sunt necesare mai mult de 2,8 milioane de infecţii rezistente la antibiotice, care să ducă la peste 35 000 de decese conform CDC. Surse tradiţionale de antibiotice şi bacterii de sol şi ciuperci au fost minate extensiv, ducând la redescoperirea compuşilor cunoscuţi. Antibioticele noi sunt necesare cu disperare pentru combaterea tulpinilor rezistente, cum ar fi ]Staphylococcus ox] (MRSA), ]Pseudomonas aeruginosa şi ]Mycobacteromy tuberculoza [FLT:]. Designarea căilor biochimice în organisme inginere oferă o rută durabilă, scalabilă pentru a descoperi şi produce în întregime noi clase de compuşi antibacterieni.

Fundamentele căilor biochimice pentru sinteza antibiotică

Antibioticele sunt produse naturale sintetizate de microorganisme prin căi biochimice complexe. Aceste căi sunt compuse de obicei dintr-o serie de reacții catalizate enzimatice care transformă precursori simpli în molecula bioactivă finală. Înțelegerea acestor căi este esențială pentru reproiectarea lor pentru a produce variante noi sau schele complet noi.

Metabolizare primară şi secundară

Biosintezele antibioticelor apar adesea din metabolism secundar . Clasele principale de enzime implicate includ sintaze poliketide (PKS), sinteze peptidice nonribozomale (NRPS) şi enzime de croire, cum ar fi metiltransferaza, hidroxizazele şi glicoziltransferaza.

Clasele principale de enzime

  • Sintaze de poliketide (PKS): Aceste enzime multimodulare asamblează lanțuri de poliketide prin condensări succesive de Claisen. PKS de tip I sunt deosebit de importante pentru antibiotice macrolide, cum ar fi eritromicină. Manipularea genetică a domeniilor PKS poate genera produse modificate de poliketide.
  • Sinteze peptide nonribozomale (NRPS): peptide sintetizate NRPS folosind o logică modulară, care încorporează aminoacizi neobișnuiti și generează structuri vertebrale găsite în antibiotice cum ar fi vancomicină și daptomicina. Schimbarea domeniului sau inginerie modulară poate produce antibiotice peptidice noi.
  • Enzime de croire: După asamblarea schelei de bază, enzimele de croire modifică molecula pentru a conferi bioactivitate, stabilitate sau transport. Exemplele includ monooxigenaze ale citocromului P450 și glicoziltransferaze.

Proiectarea căi de cale: De la descoperirea Gene la asamblare cale

Procesul de proiectare pentru noile căi antibiotice începe cu identificarea planurilor genetice clusterelor genetice (BGC) . Care codifică enzimele necesare. Progresele în secvențierea genomului și bioinformaticii au făcut posibilă minerea genomurilor bacteriene pentru BGC-uri care pot produce compuși necunoscuți (Nature Reviews Microbiology review on genome minening).

Identificarea genelor și mineritul în grup

Uneltele computerizate precum antiSMASH permit oamenilor de ştiinţă să identifice rapid BGCs în genomi microbieni. Aceste grupuri conţin adesea gene nucleice sintetazei (de exemplu genele PKS sau NRPS) împreună cu genele de reglementare şi rezistenţă. BGC-urile predictate pot fi apoi clonate din ADN-ul de mediu sau sintetizate de novo. Clusterele silenţioase care nu sunt exprimate în condiţii de laborator pot fi activate prin refactoring căi sau expresie heterologă.

Strategii de inginerie cale de parcurs

  • Refactoring:[ Eliminarea elementelor normative native și înlocuirea lor cu promotori puternici, inductibili pot crește dramatic producția.
  • Domeniul și modulul de rotire: Pentru PKS modulare și NRPS, înlocuirea unui domeniu cu un omolog poate schimba blocul de construcții monomer, generând un nou produs.
  • Enzyme Evolution Directed: Mutageneză iterativă și screening-ul pot îmbunătăți activitatea enzimatică, domeniul de aplicare al substratului sau specificitatea analogilor antibiotici doriți.

Selecţie gazdă şi expresie heterologă

Alegerea unui organism gazdă adecvat este critică. Escherichia coli și Saccharomyces cerevisiae] sunt favorizate pentru tractabilitatea lor genetică și creșterea rapidă, dar pot lipsi precursorii specifici sau mașinile posttranslaționale necesare. Streptomyces] specii, sursa naturală a multor antibiotice, oferă un mediu nativ mai lent dar pentru inginer. Strategiile comune implică exprimarea de către BGC întregi în căile precursoare prin furnizarea de streptomyces sau prin utilizarea unei abordări de tip plug-and-play în E.[ coli prin furnizarea de căi precursoare.

Unelte moderne Accelerarea designului căii de cale

Biologia sintetică și ingineria genomului au revoluționat construcția de căi biochimice. Mai multe tehnici de ultimă oră sunt utilizate în prezent pentru a accelera ciclul de proiectare-construire-test-learn.

CRISPR-Cas9 pentru editarea rapidă a genomului

CRISPR-Cas9 permite introducerea, ștergerea sau înlocuirea genelor de cale direct în genomul gazdă. În [Streptomyces, sistemele bazate pe CRISPR au redus considerabil timpul necesar pentru a elimina căile concurente sau pentru a integra clusterele genelor mari. Această tehnologie facilitează, de asemenea, editarea fără marker, care este esențială pentru producerea tulpinilor adecvate pentru fermentarea industrială (ACS Biologie sintetică articol pe CRISPR în Streptomyces).

Evoluţie directă şi optimizarea enzimatică

Evoluţia dirijată imită selecţia naturală în laborator. Prin crearea bibliotecilor de variante enzimatice prin mutageneză aleatorie sau PCR predispuse la erori, cercetătorii pot selecta pentru îmbunătăţirea eficienţei catalitice, modificarea specificităţii substratului sau stabilitatea sporită. De exemplu, evoluţia direcţionată a fost folosită pentru a proiecta un citocrom P450 care metabolizează substraturi nenaturale, permiţând producerea de derivaţi antibiotici cu proprietăţi farmacologice mai bune.

Modelare computerizată și inteligență artificială

Instrumentele de calcul joacă acum un rol central în proiectarea căii. Modelele bazate pe analiza echilibrului fluxului pot prezice blocaje metabolice și ghida strategii de knockout genă sau overexpression. Algoritmi de învățare mașini, instruite pe seturi mari de seturi de BGC cunoscute și căi, pot propune combinații noi de enzime care ar putea produce antibiotice înainte nevăzute. Instrumente, cum ar fi PathPred și RetroPath oferă sugestii înainte și căi retrosintetice, accelerarea fazei de proiectare.

Depășirea provocărilor în construcția căii ferate

În ciuda instrumentelor puternice disponibile, proiectarea și implementarea căilor pentru antibiotice noi rămâne o provocare. Multe obstacole trebuie abordate pentru a trece de la concept la producție.

Complexitatea și normele de reglementare

Căile antibiotice naturale implică adesea zeci de enzime, mai multe straturi de reglementare, și bucle complicate de inhibiție a feedback-ului. Reproducerea acestei complexități într-o gazdă heterolog poate duce la randamente scăzute sau amortizarea căii. Este necesară ajustarea atentă a concentrațiilor promotor, numerelor de copiere gene, și concentrații de inductori. În plus, multe intermediari de cale sau produse finale sunt toxice pentru celula gazdă, care necesită co-exprimarea genelor de rezistență.

Toxicitate şi sarcină metabolică

Activitatea care face antibiotice valoroase . Disrupere sinteza peretelui celulelor bacteriene, sinteza proteinelor, sau de afterie ADN poate afecta, de asemenea, gazda de producție. Strategii pentru a depăși acest lucru includ utilizarea sistemelor de expresie ortogonale, căile compartimentare în cadrul organelor (de exemplu, peroxizomi în drojdie), sau tulpini gazde de inginerie cu obiective rezistente. Sarcina metabolica de la exprimarea mare a sinttezelor poate, de asemenea, încetini creșterea; controlul metabolic dinamic folosind biosenzori poate ajuta la echilibrarea producției și viabilității.

Scalabilitate și Fermentare

Căile de acces care funcționează în recipiente cu agitare pot să nu funcționeze atunci când sunt scalate la bioreactoare industriale din cauza limitării oxigenului, a provocărilor de hrănire a substratului sau a sensibilităţii la forfecare. Dezvoltarea unor procese de fermentare robuste necesită optimizarea extinsă a compoziției mediilor, a regimurilor de hrănire și purificare în aval. Progresele în sistemele de fermentare continuă și fără celule oferă căi alternative pentru producția scalabilă.

Direcţii viitoare şi impact

Viitorul producţiei noi de antibiotice constă în integrarea disciplinelor multiple. Biologia sintetică va continua să ofere părţi genetice standardizate şi şasiu modular. Sinteza ADN-ului cu grad ridicat de scriere şi clonarea automată vor accelera construcţia a mii de variante de cale. Inteligenţa artificială va ghida probabil proiectarea unor căi biosintetice complet noi în silico] folosind învăţarea profundă pentru a prezice interacţiunile substrate enzimatice.

O perspectivă interesantă este dezvoltarea platformelor gazdă universale care pot fi reprogramate rapid pentru a produce orice antibiotic dorit la inducţie. Astfel de sisteme, combinate cu optimizarea tulpinii bazate pe învăţarea maşinilor, ar putea reduce drastic calendarul de la identificarea ţintei la producţie. În plus, aceleaşi principii de inginerie pot fi aplicate şi pentru producerea altor produse naturale valoroase, anti-anti-cancer, imunosupresoare şi biocarburanţi.

Eforturile de colaborare precum ]iniţiativele de cercetare a rezistenţei antimicrobiene globale sunt esenţiale pentru finanţarea şi coordonarea acestor eforturi. Cu investiţii susţinute, conducta de antibiotice noi poate fi realimentată, oferind medicilor arme eficiente împotriva infecţiilor rezistente la droguri.

Concluzie

Proiectarea căi biochimice pentru antibiotice noi este o strategie extrem de promițătoare pentru combaterea crizei tot mai mari de rezistență la antibiotice. Prin pârghie de minerit genom, instrumente de biologie sintetică (inclusiv CRISPR, evoluție dirijată și modelare computațională), cercetătorii pot crea și optimiza căi care produc compuși cu totul noi. Deși provocările în complexitatea căii, toxicitatea și scalabilitatea căii rămân, inovațiile în curs de desfășurare transformă rapid aceste obstacole în oportunități. Convergența continuă a bioinformatică, editarea genelor și ingineria metabolică va oferi în cele din urmă producția durabilă, rentabilă a antibioticelor de nouă generație, care economisesc nenumărate vieți în întreaga lume.