Înțelegerea provocărilor de cartilage și cultura celulelor osoase

Cartilajul şi ţesuturile osoase prezintă unele dintre cele mai formidabile obstacole în cultura celulelor primare datorită proprietăţilor lor structurale şi biochimice unice. Cartilajul, în special cartilaj articular, este avasculare şi conţine o populaţie redusă de chondrocite încorporate într-o matrice extracelulară densă (ECM) bogată în colagen tip II, aggrescan şi proteoglicani. Această matrice nu numai că rezistă digestia enzimatică, dar limitează şi difuzia de nutrienţi, fac recuperarea celulară şi proliferarea ulterioară o provocare majoră. Pe de altă parte, Bone, este un ţesut mineralizat compus din cristale hidroxiapatite depuse pe o schelă colagenoasă. Prezenţa cristalelor fosfatului de calciu necesită paşi de calcificare care pot compromite viabilitatea celulelor dacă nu este controlată cu atenţie. În plus, ţesuturile prezintă densitate scăzută a celulelor (corodinţii reprezintă mai puţin de 5% din volumul cartilajelor, iar osteocitele sunt la fel de puţine în culturi de proiectare şi de cultură robuste.

Strategii pentru izolarea cu succes a celulelor și cultură

Digestia enzimatica

Piatra de temelie a izolării celulare de țesuturile conjunctive dense este digestia enzimatică. Colagenaza (tipurile I, II sau un amestec) este enzima cea mai utilizată, deoarece degradează fibrolii de colagen nativi, eliberând celule entrapped. Pentru cartilaj, o digestie în două etape produce adesea o mai bună viabilitate: în primul rând, se utilizează un tratament scurt cu tripsină sau pronază pentru a îndepărta proteoglicanii de suprafață, urmat de o perioadă de supravieţuire prelungită (4

Decalcificarea ţesuturilor pentru oase

Înainte de digestia enzimatică, ţesutul osos trebuie decalcificat pentru a înmuia matricea minerală. Cele două abordări primare sunt agenţii chelatori (de exemplu, EDTA) şi acizii (de exemplu acid clorhidric sau formic). EDTA la pH neutru este preferată pentru studii care necesită viabilitate celulară ridicată, deoarece chelează ionii de calciu fără proteine celulare dăunătoare. Protocoale tipice incubează fragmentele osoase în 0,5 M EDTA (pH 7.4) la 4°C timp de 24 2016/1372 ore, schimbând soluţia zilnic. Decalcificarea bazată pe acid este mai rapidă, dar mai agresivă; este adesea rezervată pentru analiza histologică în care viabilitatea celulară este mai puţin critică. După decalcificare, ţesutul înmuiat este clătit bine şi apoi procesat cu digestia enzimatică standard. Cercetătorii trebuie să monitorizeze obiectivul prin testarea transparenţei radiologice sau a fildecalcificării mecanice pentru a evita supra-decalcificarea, care poate lise osteocite.

Dissociere mecanică și microdissecție

Pentru biopsii foarte mici sau atunci când digestia enzimatică este nepractică, pot fi utilizate metode mecanice. Microdissecţia sub un stereomicroscop permite izolarea precisă a firului de cartilaj sau a trabeculară a oaselor, minimizând contaminarea ţesuturilor înconjurătoare. Contaminarea ulterioară cu bisturiul creează mici explante care pot fi plasate direct în vasele de cultură (cultura explantelor). Deşi acest lucru produce iniţial mai puţine celule, creşterea celulelor de pe marginile explantului poate fi semnificativă pe parcursul a 7 ian14 zile. Dissociaţia mecanică poate fi combinată cu tratamente percolare pentru a îmbunătăţi recuperarea celulelor, în special din fibrocartilage sau cartilaj placa de creştere.

Utilizarea factorilor de creştere şi a moleculelor de semnalizare

Proteinele morfogenetice osoase (BMP-2, BMP-7) și factorul de creștere transformant (TGF-β, în special TGF-β1 și TGF-β3) sunt esențiale pentru promovarea condrogeneza și osteogeneza. Factorul de creștere al fibroblastului-2 (FGF-2) și Factorul de creștere asemănător insulinei-I (IGF-I) sunt adesea adăugate pentru a stimula ratele de proliferare și a întârzia senescența. Concentrațiile tipice variază între 1

Optimizarea mediilor de cultură și suplimentelor

Pentru chondrocite, Dulbeccos de înaltă glicemiei, Dulbeccos de înaltă glicemiei, Eagle Medium (DMEM) suplimentat cu GlutaMAX, aminoacizi neesenţiale, şi HEPES tampon este comună. Osteoblastele prosperă în α-MEM sau DMEM cu calciu redus dacă mineralizarea urmează să fie indusă mai târziu. Concentraţia plasmatică şi consistenţa lotului sunt critice; unele laboratoare folosesc 20% ser pentru primul pasaj pentru a îmbunătăţi ataşarea probelor cu randament scăzut. Antibioticele (penicilină-streptomicina) şi antifungicele (amfotericina B) sunt adăugate în timpul izolării iniţiale, dar trebuie să fie reduse odată ce culturile sunt stabilite pentru a reduce citotoxicitatea. Un indicator de pH (fenol roşu) este inclus pentru monitorizarea vizuală, dar pentru experimente sensibile, formulări fără fenol-recepţie sunt recomandate pentru a evita efectele estrogenice.

Sisteme de cultură 3D și scafldere

Cultura monostraturilor bidimensionale poate provoca dediferenţierea chondrocitelor (pierderea de colagen II şi expresia agrecană) şi a aplatizării osteoblastelor. Sistemele tridimensionale pot imita mai bine micromediul nativ. Culturile peltice (agregate celulare centifugate), culturile micromasice şi encapsulaţia hidrogelului (agaroza, alginatul, colagenul sau acid hialuronic) sunt frecvent utilizate pentru menţinerea fenotipului. Bioreactoarele care aplică compresie ciclică sau stresul de forfecare fluidă îmbunătăţesc şi mai mult producţia matricei şi alinierea celulelor. Pentru schelele osoase, poroase, realizate din hidroxiapatită, fosfat β-tricalcic sau matricea osoasă demineralizată, oferă suport structural şi cui osteoconductivi. Aceste modele avansate de cultură sunt esenţiale pentru studierea mecanobiologiei şi pentru dezvoltarea grefetelor cu inginerie tisulară.

Controlul calităţii şi caracterizarea celulelor izolate

După izolare și cultură, este imperativ să se verifice identitatea și puritatea celulelor. Pentru condrocite, markerii pozitivi includ colagen de tip II, aggrecan, SOX9 și proteina matriță oligomerică cartilaj (COMP). Markerii Osteblast includ Runx2, osterix, fosfataza alcalină și osteocalcina. Citometria fluxului, PCR cantitativă și imunofluorescența sunt metode standard. Viabilitatea ar trebui reevaluată după fiecare pasaj; un declin sub 70% indică stres. Karyotyping poate monitoriza stabilitatea tunica în timpul extinderii prelungite. În plus, fosilă funcțională . . Cum ar fi colorarea albastru alcian pentru proteoglicani în peletă de condrocite sau colorare roșie alizarină pentru depozitele de calciu în culturi osteoblaste . Connfirmă că celulele își păstrează funcțiile specializate.

Capturi comune şi depanări

Mai multe probleme apar frecvent atunci când celulele de cultură din cartilaj și oase. Culoarea scăzută de celule [ poate fi abordată prin prelungirea timpului de digestie (în limite de siguranță), utilizând enzime proaspete sau combinând metode enzimatice și explantare. Contaminarea bacteriană sau fungică[] este adesea o amenințare constantă, în special atunci când lucrează cu specimene chirurgicale; clătirea aprofundată în PBS sterile care conține 3× antibiotice înainte de prelucrare reduce riscurile. ]Dediferența [ a chondrociților este semnalată de o schimbare de la morfologia poligonală la morfologia fibroblastică; utilizarea celulelor de scriere redusă (P0 sau P1), condiții de ser-flătură sau de low-serum cu factori de creștere, iar cultura 3D poate încetini acest proces.[FLT]Atașamentul Poor[FLT:]] poate fi depășit prin suprafețe de acoperire cu tipul I, fibroectină, sau cu valori mici cu valori de masă [L]

Direcții viitoare și tehnologii emergente

Progresele recente împing limitele a ceea ce se poate realiza cu populațiile celulare limitate din țesuturile scheletului. Secvențierea ARN-ului cu celule unice a relevat eterogenitatea neașteptată între condrocite și osteocite, permițând strategii de cultură mai bine orientate. Modele organoide și microtestice care integrează tipuri multiple de celule (condrocite, osteoblaste, celule endoteliale) sunt dezvoltate pentru a studia osteoartrita și repararea oaselor. Platformele microfluide permit cultura de perfuzie a explantelor osoase și cartilajelor, menținând viabilitatea pentru săptămâni. Uneltele de editare a genelor, cum ar fi CRISPR-Cas9 pot fi introduse în celule primare pentru a studia funcția genei sau mutațiile corecte ale bolii. În plus, celulele stem pluripotente induse de țesuturi provocatoare sunt direcționate către linii condenogene și osteogenice, oferind o sursă nelimitată de celule pentru cercetare și terapie. Aceste inovații promit să depășească multe limitări inerente în cultura celulară primară.

Concluzie

Cu succes culturind celule din cartilaj și oase necesită o abordare multi-fațetă care respectă biologia unică a acestor țesuturi. Selectarea atentă a protocoalelor de digestie enzimatică, metodele de decalcificare, cocktailurile factorilor de creștere și platformele de cultură îmbunătățește dramatic producția celulară și stabilitatea fenotipică. Controlul de calitate riguros asigură faptul că celulele utilizate în aplicațiile din aval sunt autentice și funcționale. Prin adoptarea acestor strategii, cercetătorii pot debloca potențialul modelelor de celule scheletice pentru avansarea medicinei regenerative, testarea medicamentelor și înțelegerea fundamentală a bolilor musculo-scheletice. Continuarea inovării în cultura 3D, sistemele organ-on-a-chip și tehnologia celulelor stem ne va extinde în continuare capacitatea de a studia aceste țesuturi provocatoare, dar vitale [review in Curr. Osteoporos. Rep.].

Pentru protocoalele detaliate privind digestia enzimatică, a se vedea Protocoalele de natură; pentru liniile directoare privind factorul de creștere, consultați Stem Celulele de medicină translațională; și pentru tehnicile de decalcificare, consultați Metodele indexate prin PubMed.